 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2063 | 回復(fù): 5 | ||||
[交流]
PPO粗酶液的純化 已有3人參與
|
|
一、原理 1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部最先流出柱外，而小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)） 2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因?yàn)镻PO是帶有陽(yáng)離子的蛋白質(zhì)，在層析時(shí)會(huì)吸附在柱材料上，而雜蛋白會(huì)洗下。后用NaCl梯度洗脫P(yáng)PO，（NaCl為強(qiáng)離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來(lái)）。粗酶液從而得到純化。 二、材料與試劑 試劑：0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.001MEDTA)配制時(shí)配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠SephadexG-200;蘭葡萄糖－40、70、100等； 實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計(jì)和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀、GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī) 三、操作步驟 1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡 （1）柱材處理 稱取一定量的SephadexG-200干粉，加無(wú)離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細(xì)微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進(jìn)抽濾瓶中，進(jìn)行抽真空處理，直到凝膠液中沒(méi)有氣泡出現(xiàn)為止。 （2）裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過(guò)低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。 （3）平衡 在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝膠。 2．上樣：將粗酶液上柱。 3．洗脫：用0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測(cè)定。 4．DEAE－纖維素的處理及裝柱 （1）處理 本實(shí)驗(yàn)采用的是DEAE－纖維素DE52是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無(wú)離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無(wú)離子水或蒸餾水將其洗至中性。 （2）裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無(wú)離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。 （3）平衡 在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過(guò)程的緩沖液（洗脫液）置換出來(lái)，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過(guò)程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001MEDTA)，預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。 5．上樣： 將洗脫酶液上樣，用0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫雜蛋白。 6．洗脫： 用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4(內(nèi)含0.001MEDTA)進(jìn)行梯度洗脫。 7．測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)濃度。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 有價(jià)值的生物經(jīng)驗(yàn)貼 |
» 猜你喜歡
求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料277求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
數(shù)一英一271專碩（085401）求調(diào)劑，可跨
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
291求調(diào)劑
已經(jīng)有21人回復(fù)
-
一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工方向336分
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
藥學(xué)105500求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
考研調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
0703化學(xué)
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
學(xué)碩274求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
321求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
Mengjuan_wu
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 15.8
- 帖子: 8
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 5344131
- 注冊(cè): 2016-12-12
- 專業(yè): 抗體工程學(xué)
2樓2017-12-26 10:03:16
walking dead
金蟲 (小有名氣)
填料制備和蛋白純化專家
- 應(yīng)助: 40 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.001
- 金幣: 1354.8
- 散金: 59
- 紅花: 17
- 帖子: 287
- 在線: 56.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 4175016
- 注冊(cè): 2015-10-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2017-12-28 13:20:20
Mengjuan_wu
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 15.8
- 帖子: 8
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 5344131
- 注冊(cè): 2016-12-12
- 專業(yè): 抗體工程學(xué)
4樓2018-01-12 10:39:41
walking dead
金蟲 (小有名氣)
填料制備和蛋白純化專家
- 應(yīng)助: 40 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.001
- 金幣: 1354.8
- 散金: 59
- 紅花: 17
- 帖子: 287
- 在線: 56.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 4175016
- 注冊(cè): 2015-10-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
5樓2018-01-12 11:16:57
gx20
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 94.7
- 帖子: 24
- 在線: 52分鐘
- 蟲號(hào): 10132426
- 注冊(cè): 2018-09-03
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
6樓2019-09-08 20:55:58
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Nigori 的主題更新
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 學(xué)碩274求調(diào)劑 +6 | Li李魚 2026-03-26 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料與化工272求調(diào)劑 +6 | 阿斯蒂芬2004 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +14 | 鵝鵝鵝額額額額?/a> 2026-03-25 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 320分，材料與化工專業(yè)，求調(diào)劑 +7 | 一定上岸aaa 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿上海理工能源動(dòng)力（085800）310分求調(diào)劑 +3 | zhangmingc 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑（080500） +4 | A child 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 305求調(diào)劑 +5 | 哇盧卡庫(kù) 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +4 | 小懶蟲不懶了 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑323材料與化工 +7 | 1124361 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭州大學(xué)，080500學(xué)碩，總分317分求調(diào)劑 +4 | 舉個(gè)栗子oi 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 349求調(diào)劑 +4 | 李木子啊哈哈 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +3 | 邱gl 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +6 | Koxui 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0854電子信息求調(diào)劑 +7 | α____ 2026-03-22 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +3 | plum李子 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[有機(jī)交流]
 有機(jī)合成求助
 20+3
|
FENGSHUJEI 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 余意卿 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿國(guó)科過(guò)程所081700，274求調(diào)劑 +3 | 三水研0水立方 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 336化工調(diào)劑 +4 | 王大坦1 2026-03-23 | 5/250 |
|