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PPO粗酶液的純化 已有3人參與
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一、原理 1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部最先流出柱外，而小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)） 2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因?yàn)镻PO是帶有陽離子的蛋白質(zhì)，在層析時(shí)會(huì)吸附在柱材料上，而雜蛋白會(huì)洗下。后用NaCl梯度洗脫P(yáng)PO，（NaCl為強(qiáng)離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到純化。 二、材料與試劑 試劑：0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.001MEDTA)配制時(shí)配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠SephadexG-200;蘭葡萄糖－40、70、100等； 實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計(jì)和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀、GL-20C高速冷凍離心機(jī)、DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī) 三、操作步驟 1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡 （1）柱材處理 稱取一定量的SephadexG-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細(xì)微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進(jìn)抽濾瓶中，進(jìn)行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。 （2）裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。 （3）平衡 在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝膠。 2．上樣：將粗酶液上柱。 3．洗脫：用0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測(cè)定。 4．DEAE－纖維素的處理及裝柱 （1）處理 本實(shí)驗(yàn)采用的是DEAE－纖維素DE52是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。 （2）裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)儀，待層析柱的平衡。 （3）平衡 在柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內(nèi)含0.0001MEDTA)，預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。 5．上樣： 將洗脫酶液上樣，用0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001MEDTA）洗脫雜蛋白。 6．洗脫： 用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4(內(nèi)含0.001MEDTA)進(jìn)行梯度洗脫。 7．測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)濃度。 |
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