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anyeout新蟲 (初入文壇)
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[求助]
真菌PKS NPRS基因篩選 已有2人參與
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| 本人是做微生物天然產(chǎn)物的新手，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中有很多關(guān)于放線菌中PKS、NPRS基因的篩選，但是有關(guān)真菌PKS、NPRS的篩選很少，想請(qǐng)問(wèn)各位蟲友，可否用PCR方法對(duì)真菌中這兩種基因進(jìn)行篩選？引物是什么？放線菌和真菌中編碼這兩種酶的基因一樣嗎？ |
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caozhichun
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2樓2016-08-15 11:45:54
anyeout
新蟲 (初入文壇)
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3樓2016-08-16 09:29:25
starybirds
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【答案】應(yīng)助回帖
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上網(wǎng)給你找的，基因篩選的方法： 1、從基因文庫(kù)中獲得目的基因. 方法： 第一步,通過(guò)PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴(kuò)增出來(lái),進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記（也可以用別的標(biāo)記方法進(jìn)行,如生物素、熒光素等）,即用標(biāo)記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針,與擴(kuò)增出來(lái)的DNA雜交. 第二步,將基因文庫(kù)中的所有菌落轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上（也可以用其他類型的膜）,然后,通過(guò)處理溶解消化掉細(xì)菌中的蛋白質(zhì),并使DNA固定在膜上. 第三步,按Southern雜交的方法進(jìn)行雜交. 第四步,在X光底片上出現(xiàn)黑斑的菌落,這表明這個(gè)菌落中含有所需要的目的基因（若選用別的標(biāo)記方法,有陽(yáng)性信號(hào)的菌落則含有所需要的目的基因）. 第五步,從該菌落中再提取目的基因. 2、PCR 篩選法方法： 第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）加熱至90～95 ℃,使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi),變成單鏈DNA,作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板. 第二步：將反應(yīng)體系降溫至55～60 ℃,使兩種引物分別與模板DNA鏈3′端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì),這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性. 第三步：將反應(yīng)體系升溫至70～75 ℃,在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下,將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA鏈延伸,產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈. 上述三步反應(yīng)完成后,一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子,隨著重復(fù)次數(shù)的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的. 3、核酸雜交法、 DNA和DNA分子之間的雜交.目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中,這在真核生物中是目的基因可否穩(wěn)定存在和遺傳的關(guān)鍵.如何證明這一點(diǎn),就需要通過(guò)Southern雜交技術(shù).基本做法是： 第一步,將受體生物DNA提取出來(lái),經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拿盖泻?走瓊脂糖凝膠電泳,將不同大小的片段分開(kāi)； 第二步,將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上； 第三步,用標(biāo)記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進(jìn)行雜交； 第四步,將X光底片壓在硝酸纖維素膜上,在暗處使底片感光； 第五步,將X光底片沖洗,如果在底片上出現(xiàn)黑色條帶,則表明受體植物染色體DNA上有目的基因. 4、免疫篩選法 Western雜交──蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交.它是檢測(cè)目的基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)的一種方法.具體做法是： 第一步,將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)； 第二步,將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫,產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,并提取出抗體（一抗）； 第三步,從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì),走凝膠電泳； 第四步,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上； 第五步,將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交,這時(shí)抗體（一抗）與目的基因表達(dá)的蛋白（抗原）會(huì)特異結(jié)合.由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶,所以加入一種稱為二抗的抗體,它可以與一抗結(jié)合,二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記.如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì),則結(jié)果為陽(yáng)性. |
4樓2016-08-18 20:36:17
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