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小白咨詢質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)問題 已有3人參與
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大家好，我是新手對于構(gòu)建質(zhì)粒！ 第一個問題是如何看質(zhì)粒上的MCS（多克隆位點(diǎn)），是質(zhì)粒圖譜上標(biāo)準(zhǔn)的所有酶切位點(diǎn)上都是MCS，還是只是粗黑色箭頭表示的區(qū)域是MCS？ 第二個問題就是我實(shí)際中的碰到的問題，本實(shí)驗(yàn)室只有pET-32a這個表達(dá)載體，然而我老師想用pET-SUMO這個質(zhì)粒，所以我們就自己構(gòu)建；我們首先問別人要到了SUMO基因的模版，然后分別用帶有酶切位點(diǎn)的引物把SUMO基因擴(kuò)出來酶切（Ndel+Bamh1）;然后用Ndel+Bamh1酶切質(zhì)粒pET-32a;然后連接轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在總是做不出來，問題就是這樣做有問題么？嗯，我也問了群里的一些人，他們說你這樣做應(yīng)該做不出來，他們說我用Ndel這個酶切位點(diǎn)第一不再M(fèi)CS上，第二他有兩個酶切位置，你這樣酶切會把質(zhì)粒切碎，破壞質(zhì)粒的完整性，肯定擴(kuò)不出來！所以我想請問大家一下！�。。。� |
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ken19860823
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9樓2016-08-17 09:08:39
korchagin
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2樓2016-08-16 09:49:47
ken19860823
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西門吹雪170: 金幣+6, 鼓勵熱心回帖交流 2016-08-16 22:06:26
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第一個問題：MSC肯定是多克隆位點(diǎn)，一般是成簇在質(zhì)粒載體上，多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)在載體上一般是唯一的，當(dāng)然你用之前一定要用序列軟件如VECTORNTI或者snapgene去看看。載體一般很精簡的，很少多余片段，要了解載體結(jié)果，特別表達(dá)載體有嚴(yán)格限制的，你不在多克隆位點(diǎn)克隆，其他位置克隆進(jìn)去也表達(dá)不了啊。 第二個問題：你自己都把問題分析出來了啊，但是我還是不清楚你是在哪一步卡住的，首先你要擴(kuò)增出你的sumo基因（我想你的意思應(yīng)該是CDS，基因幾百kb都有，相信你們實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增不出來，擴(kuò)增4000以上就很難了）。測序這一步過了沒，因?yàn)槿绻鹲umo里面帶有你的ndeI或者BamHI,那么也是做不出來的，而且后面別人也給你了解釋，因?yàn)檩d體帶有NdeI位點(diǎn)，克隆酶切位點(diǎn)選擇不是那么麻煩，選擇目的載體多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，并且目的片段不含有的就行，當(dāng)然避免同尾酶也得考慮。單酶切就注意要載體去磷酸化就行，沒那么難。 |
3樓2016-08-16 14:25:12
4樓2016-08-16 14:25:53
5樓2016-08-16 15:47:01
6樓2016-08-16 15:52:34
ken19860823
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7樓2016-08-16 16:20:29
8樓2016-08-16 16:31:37
siriusxuan
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實(shí)驗(yàn)小白里的那只萌新啊。。。 之所以要選擇MCS區(qū)的酶切位點(diǎn)，是因?yàn)镸CS區(qū)的位點(diǎn)在整個載體骨架上都是唯一的，如果選擇的酶切位點(diǎn)不在MCS區(qū)，可能直接把你的PET-32a切碎了，你這個載體就構(gòu)建不成了，圖譜上除了MCS區(qū)的酶切位點(diǎn)，有時候也會顯示別的酶切位點(diǎn)，那些是用來改造載體，或者鑒定載體用到的，你可以直接忽略。 另外，Atg不是啟動子，是起始密碼子。 啟動子應(yīng)該是T7， 另外看了一下圖譜，目測是能夠做出來的， 測了幾次都是空載體，那就是酶的問題哦，用Nde1 切完怎么都不會轉(zhuǎn)出來空載體的。 |
10樓2016-08-17 10:43:27
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