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小白咨詢質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)問題 已有3人參與
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大家好，我是新手對于構(gòu)建質(zhì)粒！ 第一個問題是如何看質(zhì)粒上的MCS（多克隆位點），是質(zhì)粒圖譜上標準的所有酶切位點上都是MCS，還是只是粗黑色箭頭表示的區(qū)域是MCS？ 第二個問題就是我實際中的碰到的問題，本實驗室只有pET-32a這個表達載體，然而我老師想用pET-SUMO這個質(zhì)粒，所以我們就自己構(gòu)建；我們首先問別人要到了SUMO基因的模版，然后分別用帶有酶切位點的引物把SUMO基因擴出來酶切（Ndel+Bamh1）;然后用Ndel+Bamh1酶切質(zhì)粒pET-32a;然后連接轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在總是做不出來，問題就是這樣做有問題么？嗯，我也問了群里的一些人，他們說你這樣做應(yīng)該做不出來，他們說我用Ndel這個酶切位點第一不再MCS上，第二他有兩個酶切位置，你這樣酶切會把質(zhì)粒切碎，破壞質(zhì)粒的完整性，肯定擴不出來！所以我想請問大家一下�。。。。� |
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9樓2016-08-17 09:08:39
korchagin
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2樓2016-08-16 09:49:47
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第一個問題：MSC肯定是多克隆位點，一般是成簇在質(zhì)粒載體上，多克隆位點的酶切位點在載體上一般是唯一的，當(dāng)然你用之前一定要用序列軟件如VECTORNTI或者snapgene去看看。載體一般很精簡的，很少多余片段，要了解載體結(jié)果，特別表達載體有嚴格限制的，你不在多克隆位點克隆，其他位置克隆進去也表達不了啊。 第二個問題：你自己都把問題分析出來了啊，但是我還是不清楚你是在哪一步卡住的，首先你要擴增出你的sumo基因（我想你的意思應(yīng)該是CDS，基因幾百kb都有，相信你們實驗室擴增不出來，擴增4000以上就很難了）。測序這一步過了沒，因為如果sumo里面帶有你的ndeI或者BamHI,那么也是做不出來的，而且后面別人也給你了解釋，因為載體帶有NdeI位點，克隆酶切位點選擇不是那么麻煩，選擇目的載體多克隆位點的酶切位點，并且目的片段不含有的就行，當(dāng)然避免同尾酶也得考慮。單酶切就注意要載體去磷酸化就行，沒那么難。 |
3樓2016-08-16 14:25:12
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ken19860823
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7樓2016-08-16 16:20:29
8樓2016-08-16 16:31:37
siriusxuan
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實驗小白里的那只萌新啊。。。 之所以要選擇MCS區(qū)的酶切位點，是因為MCS區(qū)的位點在整個載體骨架上都是唯一的，如果選擇的酶切位點不在MCS區(qū)，可能直接把你的PET-32a切碎了，你這個載體就構(gòu)建不成了，圖譜上除了MCS區(qū)的酶切位點，有時候也會顯示別的酶切位點，那些是用來改造載體，或者鑒定載體用到的，你可以直接忽略。 另外，Atg不是啟動子，是起始密碼子。 啟動子應(yīng)該是T7， 另外看了一下圖譜，目測是能夠做出來的， 測了幾次都是空載體，那就是酶的問題哦，用Nde1 切完怎么都不會轉(zhuǎn)出來空載體的。 |
10樓2016-08-17 10:43:27
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