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病毒包裝的實驗經(jīng)驗總結(jié) 已有3人參與
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在做病毒包裝實驗中，有科研工作者常遇到：用同樣一個病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝實驗，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時常做不出來，穩(wěn)定性很差，不是滴度低就是根本不出毒，從我們對不同載體系統(tǒng)病毒包裝的多 年經(jīng)驗總結(jié)，主要以下幾個方面心得： 第一，病毒包裝的幾個關(guān)鍵節(jié)點就是細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48 小時的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響(基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功)。 第二，如果有細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的常規(guī)經(jīng)驗，細(xì)胞因素應(yīng)該沒有什么問題(細(xì)胞培養(yǎng)人員一定要關(guān)注，包裝或轉(zhuǎn)染感染前一定要重視細(xì)胞干凈細(xì)微污染與否、飽滿立體感是否好、鋪板均勻細(xì)胞密度適中否)，細(xì)胞產(chǎn)毒出毒期間過程中的活力是包裝正常和出來的病毒滴度高低的一個重要環(huán)節(jié)(正常包裝出病毒情況，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝一個細(xì)胞出一個病毒顆粒，腺病毒是1000 個，腺相關(guān)病毒是10000 個)，所以實踐操作表明，病毒包裝轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的密度要控制，使得收毒(72 小時)時細(xì)胞密度在90%-95%左右。 第三，建議使用商品化的成熟毒載體系統(tǒng)(不要用來路不清或基本被淘汰很少人在使用的系統(tǒng))，從文獻(xiàn)和我們多年的實踐可以結(jié)論，這類系統(tǒng)是穩(wěn)定的，因而分析原因時盡量少花精力在對載體系統(tǒng)的驗證上，這樣會白花力氣。 第四，至于包裝轉(zhuǎn)染時的操作控制細(xì)節(jié)及其轉(zhuǎn)染試劑因素，只要在操作時按相關(guān)使用說明和操作步驟，應(yīng)該沒有大問題，所以也不要白花太多精力在這上面。 第五，另一個需要重點關(guān)注和排查的因素就是目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建和抽提純化環(huán)節(jié)，是否構(gòu)建時導(dǎo)致質(zhì)粒載體重組或某個部件缺失，或污染別的質(zhì)�；螂s物?中抽純化是否污染?是否抽提的是別的質(zhì)粒?要養(yǎng)成同時做陰性對照的習(xí)慣(是否目的基因載體和陰性對照GFP 載體是同一批，建議同一批，建議每次包裝都如此操作)，如果這個環(huán)節(jié)沒有啥問題，在構(gòu)建中出現(xiàn)重組和缺失、或抽提純化失敗的可能性也不大。 第六，落實了上面那些因素，那就是最后一個原因。目的基因的大小、序列情況、該目的蛋白的功能毒性等導(dǎo)致無法包裝成功(實踐中，這種情況是有的，我們偶爾會遇到，可能原因是一些基因表達(dá)翻譯后對包裝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)異常)，那么我們能做的就是換病毒包裝載體系統(tǒng)，嘗試其他載體系統(tǒng)能否包裝出來。不過這種情況出現(xiàn)的幾率非常低，你做上100 個基因，也可能碰不上一個。 因而總的來說，我們進(jìn)行病毒包裝實驗時要重視包裝材料——細(xì)胞及表達(dá)質(zhì)粒(對拿過來的細(xì)胞和載體系統(tǒng)要驗證，常出現(xiàn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒就有問題，我們要定期純化生產(chǎn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒)，細(xì)胞培養(yǎng)時讓它“白白胖胖、活力充沛”，目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建純化良好，質(zhì)粒間比例得當(dāng)，病毒包裝實驗還是能有較好的結(jié)果。 版主cheff0412留言: 不要在文中附上公司鏈接 |
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engreen2016
禁蟲 (正式寫手)
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2樓2016-08-16 17:30:00
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2016-08-19 13:55:21, 158.19 K
3樓2016-08-19 13:58:04
靈兒丁當(dāng)
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 腫瘤免疫
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你好，請問我用293T包裝病毒之后，24小時換液發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解了，這是正常情況嗎？病毒包完對細(xì)胞狀態(tài)有影響嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-03-10 17:15:47
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