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Yuanfang_818金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助，雙酶切 已有4人參與
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各位道友，我將2000bp的片段插入到pET-32a中，然后雙酶切，電泳只有4000和7000之間，有一條帶，估計(jì)是32a的5900大小，沒(méi)有2000的目的條帶。怎么回事？我驗(yàn)證過(guò)質(zhì)粒，電泳在5000多，準(zhǔn)備跑PCR再驗(yàn)證一下。問(wèn)題只有質(zhì)粒嗎，還有沒(méi)有別的原因啊。求教！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2016-08-30 16:03:13
Yuanfang_818
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-01 08:26:42
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-01 08:26:42
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第一，提取的質(zhì)粒，我重新跑PCR，有目的片段，說(shuō)明片段連進(jìn)去了，質(zhì)粒沒(méi)問(wèn)題。第二，我覺(jué)得質(zhì)粒沒(méi)有切開，因?yàn)橹拔姨崛〉馁|(zhì)粒，跑電泳，片段也在5000多，我估計(jì)和32a的5900差不多，電泳區(qū)分不開。第三，我的酶切體系是50微升的，兩種酶各加了1和2微升，質(zhì)粒共加了1500ng，酶切了5個(gè)小時(shí)。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-08-30 21:14:13
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Yuanfang_818: 金幣+3, ★★★很有幫助 2016-08-31 23:11:19
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-01 08:26:50
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Yuanfang_818: 金幣+3, ★★★很有幫助 2016-08-31 23:11:19
xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-09-01 08:26:50
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提取的質(zhì)粒PCR用的什么引物？建議用質(zhì)粒的引物，不要用目的片段的引物，即使用質(zhì)粒做PCR也有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。多2000bp，即使是沒(méi)切開或發(fā)生單酶切，出來(lái)的條帶也會(huì)與空載體不同，所以你的這個(gè)我覺(jué)得還是假陽(yáng)性。 |
4樓2016-08-30 23:59:58
Yuanfang_818
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5樓2016-08-31 01:55:31
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6樓2016-09-01 08:17:12
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7樓2016-09-01 13:35:23
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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質(zhì)粒的量你自己定，我想寫的應(yīng)該是1ug，不過(guò)我每次都沒(méi)用那么多。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2016-09-01 13:37:34
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