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15871472357金蟲 (小有名氣)
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[交流]
反向PCR
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我要從gDNA擴(kuò)一個(gè)基因，怎么也擴(kuò)不出來，然后文獻(xiàn)用的是反向PCR法，可是我看了，還是不懂怎么操作的，求各位了解反向pcr的大神給翻譯翻譯，謝謝，小弟散金求結(jié)果，因?yàn)轳R上要開組會(huì)了 疑問：1、剛開始酶切g(shù)DNA用的是什么內(nèi)切酶？ 2、為什么后面加入25ul的反應(yīng)體系，加的模板是3ul的環(huán)話模板，為什么不是第二次酶切的模板？ 3、為什么gDNA要經(jīng)過濾膜過濾？ 360截圖20160908152938371.jpg |
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2樓2016-09-08 15:43:22
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3樓2016-09-08 20:55:53
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4樓2016-09-08 20:58:18
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| 反向PCR一般用于從一段已知序列擴(kuò)增兩側(cè)未知序列，參考文獻(xiàn)選擇SwaI是一個(gè)識(shí)別8個(gè)堿基的酶切位點(diǎn)，應(yīng)該是在已知序列中不存在識(shí)別位點(diǎn)的酶，而且需要擴(kuò)增的兩側(cè)序列比較長，才需要識(shí)別8的堿基的內(nèi)切酶。酶切連接環(huán)化，就成了一個(gè)類似質(zhì)粒的環(huán)狀DNA，可以從已知序列向兩外側(cè)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物測序，找到酶切位點(diǎn)，比如參考文獻(xiàn)的是SwaI，以此為止模擬切開，得到已知序列兩外側(cè)到酶切位點(diǎn)之間的序列信息。 |
5樓2016-09-13 16:42:50
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6樓2016-09-21 16:19:26
7樓2016-09-21 23:55:48
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