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籣103103管理員
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流式細(xì)胞術(shù)常見問題問答 已有1人參與
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1、流式細(xì)胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？ FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。 2、流式同型對照怎樣選擇？ 同型對照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用annormal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primaryantibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely inimmunohistochemicalstaining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來源不同，應(yīng)選用相同來源的未標(biāo)記單抗作為同型對照來調(diào)整背景染色。舉個例子：比如檢測一抗為單抗的mouseanti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來做OX-42的同型對照（Isotype Control）。一般的的生物技術(shù)公司和國內(nèi)的代理都有出售。 同型對照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為最佳，這對準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照，最好為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。 3、流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測定游離鈣的方法，具體如下： （1） 鈣熒光探針負(fù)載； （2）隨機(jī)測定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡稱樣品）的單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。 （3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測定熒光即Fmax值。 （4）加入EGTA，20%26mu;l（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長488nm測定熒光，即Fmin值。 這個過程中的氯化鈣的作用如何， 請高人指點(diǎn)， 謝謝。 因?yàn)檎Ｑ獫{中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為最小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對鈣的通透性變化對細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。 4、流式與werstern的區(qū)別，知道一些，不足之處請大家補(bǔ)充： （1）Western 是檢測蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于檢測細(xì)胞多種類型的蛋白；流式細(xì)胞術(shù)的方法多用于檢測細(xì)胞膜蛋白，雖然也可通過Triton-X100給細(xì)胞打孔的方法來檢測胞內(nèi)蛋白，但對于分泌蛋白卻是無能為力的； （2）Western測蛋白含量對抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費(fèi)抗體）； （3）采用Western方法檢測細(xì)胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參，而流式一般要把每個樣品分為兩份，同時都做只加二抗（FITC標(biāo)記的）的對照，這樣平均到每個細(xì)胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了； （4）就個人經(jīng)驗(yàn)而言，流式用多抗不好，單抗標(biāo)出來不錯。 不過流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測低表達(dá)的蛋白，低表達(dá)的還是采用western（尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳）和免疫組化更好。當(dāng)然，流式最大的一個特點(diǎn)就是，可以定量（百分比），如果是高表達(dá)的用流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢。 5、FL1， FL2， FL3 的區(qū)別是什么? 是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數(shù)到底測的是什么?有什么意義? 你的理解是正確的，其實(shí)FL1， FL2， FL3 是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細(xì)胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長不同的綠色和橙色熒光，然后這發(fā)出的熒光再通過濾光片分開，對應(yīng)的是不同的波長的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。 6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細(xì)胞術(shù)？ 看你說明書上是怎么說的了，如果沒有說就不可以做流式，需要另外買了。 7、MFI和GFI的意義？ Geo Mean，叫做幾何均數(shù)（geometricmean），常用于等級資料和對數(shù)正態(tài)分布資料，和常用的算數(shù)均數(shù)（mean）的計算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結(jié)果%26rdquo;代表的是百分率，即細(xì)胞占總體細(xì)胞或者是門內(nèi)細(xì)胞的百分比；用百分比作為統(tǒng)計指標(biāo)，適用于熒光表達(dá)較強(qiáng)的指標(biāo)。我看到你的流式圖上，檢測樣本的熒光強(qiáng)度不是很強(qiáng)，屬于弱表達(dá)的指標(biāo)，若用百分率統(tǒng)計，就是會失去一部分弱陽性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強(qiáng)度（也就是mean值）作為統(tǒng)計指標(biāo)，比較熒光強(qiáng)度的變化。 8、流式技術(shù)中的APC，pure 標(biāo)記是什么意思呢? 熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個波長激發(fā)后，處于一個能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個波長比激發(fā)波長長的光的一類物質(zhì)。當(dāng)然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的，如一些生物可以發(fā)射熒光，如熒火蟲，發(fā)光細(xì)菌等，他們發(fā)出的光是通過體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，這個酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì)，它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見光，常用于DNA、RNA電泳中。 APC 英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大發(fā)射熒光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600-640nm波長的激光激發(fā)。 PerCP 英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；最大激發(fā)波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光峰值約為677nm，與FITC、PE進(jìn)行多色熒光染色補(bǔ)償重疊較少，非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用，但量子產(chǎn)量不高，多用于檢測表達(dá)較高的抗原。 9、怎樣用流式細(xì)胞儀來鑒定小鼠BMDC？ 檢測小鼠BMDC主要是從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子兩方面來鑒定我做的時候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡（掃描和透射），另外檢測了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。還做了MHC II類分子的檢測，還有MHCI類分子的檢測，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面也有表達(dá)，所以目前并沒有非常特異性的方法檢測你的細(xì)胞一定就是DC，但是從形態(tài)和表面分子的檢測結(jié)合來看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達(dá)水平較低，DC成熟過程中，上述分子表達(dá)呈上調(diào)趨勢，你可以在不同的培養(yǎng)時間分別檢測。 10、請問流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對照？ 首先確認(rèn)你用的直標(biāo)抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來源種屬，選擇相應(yīng)的同型對照。如：你現(xiàn)在想檢測小鼠淋巴細(xì)胞表面的CD4抗原，熒光染料為FITC， 抗體來源為大鼠的IgG1亞型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型對照就應(yīng)該是Rat IgG1-FITC， 一般的抗體說明上都會寫清。  |
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2樓2017-04-13 18:55:08
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