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籣103103超級(jí)版主
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流式細(xì)胞術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)答 已有1人參與
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1、流式細(xì)胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？ FL2-W是只檢測(cè)熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時(shí)應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。 2、流式同型對(duì)照怎樣選擇？ 同型對(duì)照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用annormal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primaryantibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely inimmunohistochemicalstaining.這個(gè)可以咨詢(xún)?cè)噭┥�。同型�?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來(lái)源不同，應(yīng)選用相同來(lái)源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來(lái)調(diào)整背景染色。舉個(gè)例子：比如檢測(cè)一抗為單抗的mouseanti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來(lái)做OX-42的同型對(duì)照（Isotype Control）。一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。 同型對(duì)照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類(lèi)，若使用直接免疫熒光染色法，同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對(duì)照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為最佳，這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽(yáng)性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對(duì)照，最好為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。 3、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)及其他專(zhuān)業(yè)網(wǎng)站中都有測(cè)定游離鈣的方法，具體如下： （1） 鈣熒光探針負(fù)載； （2）隨機(jī)測(cè)定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)樣品）的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。 （3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問(wèn)題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測(cè)定熒光即Fmax值。 （4）加入EGTA，20%26mu;l（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定熒光，即Fmin值。 這個(gè)過(guò)程中的氯化鈣的作用如何， 請(qǐng)高人指點(diǎn)， 謝謝。 因?yàn)檎Ｑ獫{中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為最小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。 4、流式與werstern的區(qū)別，知道一些，不足之處請(qǐng)大家補(bǔ)充： （1）Western 是檢測(cè)蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于檢測(cè)細(xì)胞多種類(lèi)型的蛋白；流式細(xì)胞術(shù)的方法多用于檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白，雖然也可通過(guò)Triton-X100給細(xì)胞打孔的方法來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)蛋白，但對(duì)于分泌蛋白卻是無(wú)能為力的； （2）Western測(cè)蛋白含量對(duì)抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對(duì)抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費(fèi)抗體）； （3）采用Western方法檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參，而流式一般要把每個(gè)樣品分為兩份，同時(shí)都做只加二抗（FITC標(biāo)記的）的對(duì)照，這樣平均到每個(gè)細(xì)胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了； （4）就個(gè)人經(jīng)驗(yàn)而言，流式用多抗不好，單抗標(biāo)出來(lái)不錯(cuò)。 不過(guò)流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒(méi)有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測(cè)低表達(dá)的蛋白，低表達(dá)的還是采用western（尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳）和免疫組化更好。當(dāng)然，流式最大的一個(gè)特點(diǎn)就是，可以定量（百分比），如果是高表達(dá)的用流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢(shì)。 5、FL1， FL2， FL3 的區(qū)別是什么? 是指在不同位置測(cè)得的熒光?還是不同波長(zhǎng)的熒光?這3個(gè)參數(shù)到底測(cè)的是什么?有什么意義? 你的理解是正確的，其實(shí)FL1， FL2， FL3 是指不同的熒光通道.舉個(gè)例子來(lái)說(shuō)吧.我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細(xì)胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長(zhǎng)不同的綠色和橙色熒光，然后這發(fā)出的熒光再通過(guò)濾光片分開(kāi)，對(duì)應(yīng)的是不同的波長(zhǎng)的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開(kāi)了。 6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細(xì)胞術(shù)？ 看你說(shuō)明書(shū)上是怎么說(shuō)的了，如果沒(méi)有說(shuō)就不可以做流式，需要另外買(mǎi)了。 7、MFI和GFI的意義？ Geo Mean，叫做幾何均數(shù)（geometricmean），常用于等級(jí)資料和對(duì)數(shù)正態(tài)分布資料，和常用的算數(shù)均數(shù)（mean）的計(jì)算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結(jié)果%26rdquo;代表的是百分率，即細(xì)胞占總體細(xì)胞或者是門(mén)內(nèi)細(xì)胞的百分比；用百分比作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，適用于熒光表達(dá)較強(qiáng)的指標(biāo)。我看到你的流式圖上，檢測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度不是很強(qiáng)，屬于弱表達(dá)的指標(biāo)，若用百分率統(tǒng)計(jì)，就是會(huì)失去一部分弱陽(yáng)性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強(qiáng)度（也就是mean值）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，比較熒光強(qiáng)度的變化。 8、流式技術(shù)中的APC，pure 標(biāo)記是什么意思呢? 熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)后，處于一個(gè)能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)的光的一類(lèi)物質(zhì)。當(dāng)然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的，如一些生物可以發(fā)射熒光，如熒火蟲(chóng)，發(fā)光細(xì)菌等，他們發(fā)出的光是通過(guò)體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，這個(gè)酶通常被稱(chēng)為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì)，它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見(jiàn)光，常用于DNA、RNA電泳中。 APC 英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大發(fā)射熒光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600-640nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)。 PerCP 英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；最大激發(fā)波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光峰值約為677nm，與FITC、PE進(jìn)行多色熒光染色補(bǔ)償重疊較少，非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用，但量子產(chǎn)量不高，多用于檢測(cè)表達(dá)較高的抗原。 9、怎樣用流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定小鼠BMDC？ 檢測(cè)小鼠BMDC主要是從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子兩方面來(lái)鑒定我做的時(shí)候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡（掃描和透射），另外檢測(cè)了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。還做了MHC II類(lèi)分子的檢測(cè)，還有MHCI類(lèi)分子的檢測(cè)，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面也有表達(dá)，所以目前并沒(méi)有非常特異性的方法檢測(cè)你的細(xì)胞一定就是DC，但是從形態(tài)和表面分子的檢測(cè)結(jié)合來(lái)看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達(dá)水平較低，DC成熟過(guò)程中，上述分子表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，你可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間分別檢測(cè)。 10、請(qǐng)問(wèn)流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對(duì)照？ 首先確認(rèn)你用的直標(biāo)抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來(lái)源種屬，選擇相應(yīng)的同型對(duì)照。如：你現(xiàn)在想檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞表面的CD4抗原，熒光染料為FITC， 抗體來(lái)源為大鼠的IgG1亞型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型對(duì)照就應(yīng)該是Rat IgG1-FITC， 一般的抗體說(shuō)明上都會(huì)寫(xiě)清。  |
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2樓2017-04-13 18:55:08
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