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細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 已有2人參與
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實(shí)驗(yàn)方法原理 細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 實(shí)驗(yàn)材料 Annexin V-FITC 試劑、試劑盒 標(biāo)記緩沖液PBS去離子水冰塊 儀器、耗材 移液器吸頭微量離心管可調(diào)速離心機(jī)載玻片蓋玻片流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡 實(shí)驗(yàn)步驟 1. 凋亡細(xì)胞的制備 小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2×106 /ml，備用。 2. 200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。 3. 重復(fù)步驟2兩次。 4. 將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。 5. 加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。 6. 加入300 μl標(biāo)記緩沖液，立即上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)。 注意事項(xiàng) 1. 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。 2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。 3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。 其他 一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用熒光顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上可見(jiàn)黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時(shí)結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細(xì)胞儀分析可檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。 |
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ysk1989 
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英格恩生物CCAA試劑盒產(chǎn)品介紹 CCAA試劑盒，Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit，是基于PI染色(Propidium staining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析的試劑盒。 PI (Propidium，碘化丙啶) 是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，其強(qiáng)度與DNA含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被PI染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，根據(jù)DNA含量的分布情況，進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。 本試劑盒通常用于貼壁或懸浮細(xì)胞的周期與凋亡檢測(cè)。如果用于組織，則需要把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，再可以進(jìn)行檢測(cè)。 主要特點(diǎn) PI染液即開(kāi)即用，無(wú)需再用緩沖液配制。 PI染液4℃存放，無(wú)需解凍，方便隨時(shí)取用。 不需要提前用RNA酶消化，超快，省時(shí)。 CCAA |
2樓2016-09-19 12:53:46
趙炎
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3樓2016-11-17 15:55:57
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