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huaizhenkai新蟲 (小有名氣)
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目的蛋白與雜蛋白分子量相差一倍之上，但是利用分子篩Superdex柱子分不開？ 已有4人參與
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鄙人剛開始接觸蛋白純化，碰到的問(wèn)題如下還忘各位高手踴躍回答。 我的目的蛋白包含10His tag，分子量約32kd。首先利用FF鎳柱純化后的結(jié)果見圖1右邊兩條帶：可見除目的蛋白之外，還有兩條雜蛋白帶（約70kd和110kd左右）；再查詢文獻(xiàn)之后（目的蛋白為老靶點(diǎn)蛋白，已經(jīng)有人純化過(guò)該蛋白），決定嘗試Superdex 75 10/300 GL（全新的）利用AKTA purifier分離純化，吸收?qǐng)D結(jié)果如圖2（忘記保存了，大概峰形見手繪圖），按照峰形接收蛋白洗脫液時(shí)，將洗脫液接收為12管，每管200-500 微升不等，然后跑SDS-PAGE膠結(jié)果如圖3，蛋白完全沒分開��？？因此問(wèn)題如下： 1. 雜蛋白按照分子量來(lái)像目的蛋白的二三聚體，怎么確定？ 2. Superdex 75柱子分離范圍為3-70 kd，理論上只要雜蛋白和目的蛋白分子量差一倍就可以使用該柱子分離，但是為什么我的蛋白完全沒有分開？從峰開始，中間，結(jié)尾分開接收的11 管洗脫液跑出來(lái)的膠完全一個(gè)樣子，都是三條帶？ 3，看了幾篇質(zhì)量還可以的文獻(xiàn)，他們都是過(guò)了鎳柱和分子篩，純度就可以上核磁了，我這分子篩完全分不開，是我實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出了問(wèn)題，還是。。？ 忘高手指點(diǎn)啊 1 鎳柱純化結(jié)果.jpg 2. AKTA吸收峰圖.jpg 3. Superdex 75 洗脫液膠圖 1.鎳柱純化結(jié)果.jpg |
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| 如你所說(shuō)，Superdex 75柱子分離范圍為3-70 kd，如果雜蛋白是大于70kd，理論上你雜蛋白是外水全排阻，可以實(shí)現(xiàn)分離。但是雜蛋白的分子量也有些是小與70kd的。所以這個(gè)分子篩實(shí)現(xiàn)你目標(biāo)蛋白更高純度的純化很難實(shí)現(xiàn)。你可以考慮你目標(biāo)蛋白和雜蛋白的電荷情況，結(jié)合離子交換介質(zhì)試試。祝你順利。 |
6樓2016-09-26 09:24:01
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8樓2016-09-26 10:48:09
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1. WB看看兩個(gè)大小的位置是否都有你的tag。如果都有，就很有可能是多聚體。 2. 主要是看是否高于柱子飽和上限了，你如果擔(dān)心可以降低上樣量。非變性膠就是native-page。 3. 拿到二維應(yīng)該可以很容易分辨出大概的氨基酸個(gè)數(shù)，特別是想色氨酸這種，出峰位置特別，可以數(shù)出來(lái)的。如果樣品中有大量其他蛋白，很容易就辨認(rèn)出來(lái)了。至于多聚體之類的，估計(jì)要區(qū)分比較困難。 另外樓下說(shuō)的離子交換你可以試試，蛋白分離無(wú)外乎就是親和柱，離子交換柱和分子篩三種手段。 |
12樓2016-09-26 13:27:07
fuyuandj86
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1. SDS-PAGE 是變性膠，大多數(shù)情況二三聚體不會(huì)出現(xiàn)。 2. 不要貪圖產(chǎn)率，收兩個(gè)峰中間的組分。 純度第一，產(chǎn)率第二。試下只收第一個(gè)峰的前一半。 3. 實(shí)在不行就換實(shí)驗(yàn)方法，比如用鈷柱取代鎳柱�；蛘逳端一個(gè)標(biāo)簽，C端再來(lái)個(gè)純化標(biāo)簽 |
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huaizhenkai2樓2016-09-25 08:09:15
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1. PAGE上樣的buffer是否含有還原性的DTT或者巰基乙醇？如果沒有，加點(diǎn)試試。蛋白可能通過(guò)二硫鍵形成多聚體，跟是否SDS變性無(wú)關(guān)@二樓。當(dāng)然你也可以做WB，你的蛋白含有HIS-tag。這樣可以判斷其他兩個(gè)是否也是你的蛋白多聚體。 2. 按照你的描述，這些蛋白都一起下柱的話，如果不是你上樣量過(guò)大的話，還有另外一種可能是這些蛋白和你的蛋白結(jié)合，比如是伴侶蛋白。DnaK和GroES都是70KDa左右。你也可以跑非變性膠判斷。 3. 這個(gè)很難說(shuō)，建議你試試我上面講的。當(dāng)然，你是土豪的話直接做核磁看個(gè)二維HSQC也可以判斷吧：）。 |
5樓2016-09-25 18:30:23
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你好，謝謝你的解答。 1. Buffer中是有1mM DTT的。不好意思，不太明白你說(shuō)的？你說(shuō)的Western blotting方法，因?yàn)槲业哪康牡鞍缀蠬is-tag就可以區(qū)分二三聚體了？？聚體區(qū)分原理是什么，可以說(shuō)的詳細(xì)一些嗎？ 2. 我的上樣蛋白挺濃的，上樣量800微升，濃度用Protein 280 的方法大于10mg了，你的意思是我可以降低濃度再上下柱子試一下？我在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白時(shí)候，也可以表達(dá)出伴侶蛋白嗎？您指的非變性膠是什么膠？ 3. 我這個(gè)蛋白純出來(lái)就是要做二維或三維NMR的，如果是二三聚體的話，圖譜能明顯地看出來(lái)嗎？ |
9樓2016-09-26 11:11:52
huaizhenkai
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