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現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)簡(jiǎn)介
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分子生物技術(shù)在藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛，包括核酸分子探針的標(biāo)記、核酸分子雜交、多聚酶鏈反應(yīng)、蛋白印跡雜交技術(shù)、cDNA文庫(kù)、隨機(jī)分子庫(kù)技術(shù)、外核基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、人類基因治療等。現(xiàn)將更為常用的技術(shù)介紹如下： 一、核酸分子探針的標(biāo)記 標(biāo)記核酸分子探針（nucleic acid probe）是進(jìn)行核雜交的基礎(chǔ)，根據(jù)核酸分子探針的來源及性質(zhì)進(jìn)行選擇，選擇的基本原則是具有高度的特異性，探針選擇直接影響雜交結(jié)果的分析。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象和目的不同，，可選擇不同的探針種類及標(biāo)記方法。 ㈠ 探針種類 1．基因組DNA探針 是克隆化的各種基因片斷，也是最常用的核酸探針，探針應(yīng)盡可能選用基因編碼（外顯子），避免使用內(nèi)含子及其它非編碼序列。 2．cDNA探針 與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈稱cDNA，是一種較為理想的核酸探針，特異性較高。 3．RNA探針 RNA與RNA或DNA雜交體的探針穩(wěn)定性，特異性高。 4．寡核苷酸探針 人工合成寡核苷酸片段做探針，可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列。 ㈡ 標(biāo)記物 常用的探針標(biāo)記物有兩類：放射性同位素和非放射性同位素。標(biāo)記物的檢測(cè)具有高度靈敏性和特異性。標(biāo)記和探針結(jié)合不影響雜交的特異性和穩(wěn)定性。其中放射性同位素是應(yīng)用最多的探針標(biāo)記物，但易造成放射性污染，多數(shù)同位素的半衰期短，不能長(zhǎng)期存放。常用的放射性同位素有32P¸3P¸35S，有時(shí)也用14C,125I或131I。 二、核酸分子雜交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈在一定的條件下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過程。核酸分子雜交是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，主要用于特異DNA或RNA的定性定量檢測(cè)。 三、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片段的方法。傳統(tǒng)的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法，需經(jīng)過DNA酶切、鏈接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建含有目的基因的載體。然后導(dǎo)入細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，再用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行篩選，操作復(fù)雜，耗時(shí)。PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便。PCR是本世紀(jì)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最重要的發(fā)明之一。 四、cDNA文庫(kù) 是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ) DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文庫(kù)是指一群含重組DNA細(xì)菌或嗜菌體克隆。每一個(gè)克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目克隆的總和則含細(xì)胞的全部mRNA信息，此種克隆群體叫cDNA文庫(kù)。 五．隨機(jī)分子庫(kù)技術(shù)（random moleculer library） 采用不同技術(shù)手段和在不同的分子水平有效地實(shí)現(xiàn)分子的多樣性。其技術(shù)路線，一是利用化學(xué)合成的方法生成已知結(jié)構(gòu)的化合物，以某種特定方式和一定規(guī)律組合在一起，只要確定某一化合物具有活性，即可根據(jù)建庫(kù)的組合方式確定其結(jié)構(gòu)，圍繞此技術(shù)發(fā)展的隨機(jī)分子庫(kù)總稱為化學(xué)合成庫(kù)（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸庫(kù)（nucleic acid library ）,由DNA隨即編碼表達(dá)的小分子和大分子的混合群體而表達(dá)物的表面顯露又提供了可從龐大的復(fù)雜的群體中快速篩選到目的物，這就是近幾年發(fā)展起來的極富有應(yīng)用潛力的核酸編碼分子肽庫(kù)（oligonucleotide-encoded peptide library ）。 六．真核基因的表達(dá)調(diào)控技術(shù) 真核細(xì)胞具有比原核細(xì)胞更為龐大的和復(fù)雜的基因組。高等真核細(xì)胞基因組編碼成千上萬個(gè)基因，基因內(nèi)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程，即基因表達(dá)過程受不同層次調(diào)節(jié)機(jī)制精密調(diào)控，此調(diào)控既決定著基因表達(dá)的量，又決定基因表達(dá)的時(shí)空順序。調(diào)控過程精密復(fù)雜，涉及到轉(zhuǎn)錄前染色質(zhì)的活化；轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；轉(zhuǎn)錄后的加工；翻譯水平的調(diào)節(jié)及翻譯后的修飾等�；虮磉_(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。 七．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 是用實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。此種方法可建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以研究外源基因在整體動(dòng)物中的表達(dá)調(diào)控率；能改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)更符合人類需要；也可用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生人類所需要的生物活性物質(zhì)。 ～～～～～～ ～～～～～～ 下載：http://ishare.iask.sina.com.cn/f/16503830.html |
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