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sdjnyxn123銀蟲 (小有名氣)
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請問SDS-PAGE每次都跑成這樣是時(shí)間太長還是不夠��？ 已有1人參與
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基本每次跑都跑成這樣，我的目的蛋白大小比較小，有一個甚至是10kD以下的 請問看這圖的話是跑過頭了還是跑得還不夠啊？ 這次是80V跑了1h，然后改成100V跑了2h零5min的 以前跑過40min+1h40min的也幾乎是這樣 是應(yīng)該再跑一段時(shí)間還是提前一些呢？ 而且現(xiàn)在跑的條帶特別模糊，是因?yàn)榕艿脮r(shí)候發(fā)熱太嚴(yán)重嗎？ 我試過一次恒流跑，30mA跑了三個多小時(shí)才跑到中間··· 如何能跑出別人那種條帶清晰分明，并且低分子量也很清晰的條帶呢？ |
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2樓2016-10-26 18:58:32
熊以揚(yáng)
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3樓2016-10-26 20:54:55
winyuyuyu123
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kuaile5420: 金幣+3, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 20:54:39
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kuaile5420: 金幣+3, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 20:54:39
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樓主，看了你的電泳圖，我有幾個建議： 1.關(guān)于條帶不直有拖尾，可能是凝膠不均勻，也可能是蛋白有降解。建議配膠前，洗凈夾板晾干；配膠時(shí)充分混勻再灌膠。制備樣品時(shí)加入少許PMSF和DTT，樣品的預(yù)處理，加入5X SDS-Loading后沸水煮10min，再上樣。 2.關(guān)于條帶寬度不一，是因?yàn)槟愕纳蠘恿坎痪�。建議在蛋白樣品制備后，做一個BCA定量，一個小時(shí)就搞定，然后取等量的蛋白樣品（如10μg），用1X SDS-Loading補(bǔ)齊至等體積上樣電泳。 3.關(guān)于最左側(cè)條帶彎曲，是電泳時(shí)的邊沿效應(yīng)導(dǎo)致。建議是用等體積的1X SDS Loading加入到空的點(diǎn)樣孔進(jìn)行平衡。 4.關(guān)于凝膠大小及底部皺縮。濃度越大的凝膠，塑性越強(qiáng)，但是也容易因干燥而卷曲皺縮。因此在拍照前及拍照時(shí)，要保持凝膠濕潤，可往上澆灑少許電泳液。 5.關(guān)于蛋白分子量，不同濃度的凝膠分辨率不一，Takara說明書上寫的很詳細(xì)，15-40kd用12%的gel，20kd以下用15%gel。 6.樓主這個電泳圖不知是否有Marker，因此實(shí)在看不出10kd條帶應(yīng)該在哪。建議樓主買個預(yù)染的Marker，電泳時(shí)就可分辨不同大小條帶位置，從而調(diào)整最適電泳時(shí)間。至于Marker規(guī)格，根據(jù)你自己的蛋白大小去選擇。 以上 |
4樓2016-10-27 08:47:26
bright8
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
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1濃縮膠沒有配好,導(dǎo)致樣品沒有濃縮好；2上樣之前離心一下,取上清；3跑一個蛋白marker看一下，是否膠有問題；曾經(jīng)試過250V電壓,膠跑的也挺好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-10-28 10:56:23
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
6樓2016-10-28 11:17:18
7樓2016-10-29 18:02:33
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