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sdjnyxn123銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
請問SDS-PAGE每次都跑成這樣是時間太長還是不夠啊？ 已有1人參與
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基本每次跑都跑成這樣，我的目的蛋白大小比較小，有一個甚至是10kD以下的 請問看這圖的話是跑過頭了還是跑得還不夠啊？ 這次是80V跑了1h，然后改成100V跑了2h零5min的 以前跑過40min+1h40min的也幾乎是這樣 是應該再跑一段時間還是提前一些呢？ 而且現在跑的條帶特別模糊，是因為跑得時候發(fā)熱太嚴重嗎？ 我試過一次恒流跑，30mA跑了三個多小時才跑到中間··· 如何能跑出別人那種條帶清晰分明，并且低分子量也很清晰的條帶呢？ |
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2樓2016-10-26 18:58:32
3樓2016-10-26 20:54:55
winyuyuyu123
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數 +1
kuaile5420: 金幣+3, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 20:54:39
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kuaile5420: 金幣+3, 歡迎發(fā)帖交流 2016-10-27 20:54:39
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樓主，看了你的電泳圖，我有幾個建議： 1.關于條帶不直有拖尾，可能是凝膠不均勻，也可能是蛋白有降解。建議配膠前，洗凈夾板晾干；配膠時充分混勻再灌膠。制備樣品時加入少許PMSF和DTT，樣品的預處理，加入5X SDS-Loading后沸水煮10min，再上樣。 2.關于條帶寬度不一，是因為你的上樣量不均一。建議在蛋白樣品制備后，做一個BCA定量，一個小時就搞定，然后取等量的蛋白樣品（如10μg），用1X SDS-Loading補齊至等體積上樣電泳。 3.關于最左側條帶彎曲，是電泳時的邊沿效應導致。建議是用等體積的1X SDS Loading加入到空的點樣孔進行平衡。 4.關于凝膠大小及底部皺縮。濃度越大的凝膠，塑性越強，但是也容易因干燥而卷曲皺縮。因此在拍照前及拍照時，要保持凝膠濕潤，可往上澆灑少許電泳液。 5.關于蛋白分子量，不同濃度的凝膠分辨率不一，Takara說明書上寫的很詳細，15-40kd用12%的gel，20kd以下用15%gel。 6.樓主這個電泳圖不知是否有Marker，因此實在看不出10kd條帶應該在哪。建議樓主買個預染的Marker，電泳時就可分辨不同大小條帶位置，從而調整最適電泳時間。至于Marker規(guī)格，根據你自己的蛋白大小去選擇。 以上 |
4樓2016-10-27 08:47:26
bright8
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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1濃縮膠沒有配好,導致樣品沒有濃縮好；2上樣之前離心一下,取上清；3跑一個蛋白marker看一下，是否膠有問題；曾經試過250V電壓,膠跑的也挺好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-10-28 10:56:23
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本帖內容被屏蔽 |
6樓2016-10-28 11:17:18
7樓2016-10-29 18:02:33
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