 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1467 | 回復(fù): 2 | ||||
[交流]
自己總結(jié)的western操作步驟，簡(jiǎn)單實(shí)用 已有2人參與
|
|
自己總結(jié)的western操作步驟，簡(jiǎn)單實(shí)用 1．制膠及上樣： （1）配制12%SDS-PAGE分離膠，混勻后注入邊條厚度為2mm的兩塊潔凈玻璃板間，其上加一薄層異丙醇，室溫下靜置至凝固。 （2）待分離膠完全聚合后，傾去其上的水層，以吸水紙吸凈殘余液體，插入加樣梳，緩緩加入濃縮膠，使其充滿加樣梳間的空隙，室溫下靜置。待膠完全聚合。 （3）將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩沖液。 （4）小心拔去加樣梳，使加樣孔豎直，以電泳緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。 （5）分別取50μg蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量Marker，按4：1體積比加入5′樣品緩沖液，以1′樣品緩沖液？配平上樣體積（總體積20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白變性。 （6）將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入分離膠的上樣孔中。 2．電泳 （1）接通凝膠電泳儀的電源，初始電壓70V。（約30分鐘） （2）溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至160V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠的下緣。（約60分鐘） 3．轉(zhuǎn)膜 （1）從玻璃板中取出凝膠，將其浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。 （2）取與膠同樣大小的硝酸纖維素膜，以95%乙醇浸泡5秒鐘后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液5分鐘以上待用。 （3）按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。 （4）將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，膜在正極、膠在負(fù)極，接冷卻循環(huán)水，90V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移2小時(shí)。 4．染色 （1）將硝酸纖維素浸入麗春紅使用液中，振搖染色5-10min。 （2）蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)后，用去離子水洗去硝酸纖維膜上的麗春紅底色。 （3）按照蛋白質(zhì)分子量Marker指示的位置剪下目的條帶所在的硝酸纖維素膜。 5．封閉 把硝酸纖維素膜浸入5%脫脂奶粉，室溫?fù)u動(dòng)2小時(shí)。 6．洗膜與雜交 （1）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 （2）第一抗體封閉： SPARC單抗以T-TBS 1：200稀釋，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，4℃振搖過夜。 （3）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 （4）第二抗體封閉：辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，室溫下振搖60分鐘。 （5）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 7．化學(xué)發(fā)光與曝光 （1）將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動(dòng)孵育1分鐘。 （2）用濾紙沾干膜上的液體，用保鮮膜包好，用感光膠片在壓片盒中曝光約1分鐘。 （3）曝光后的感光膠片在顯影液中顯影約30秒鐘，定影液中定影1分鐘，用水沖洗后晾干。 （4）根據(jù)曝光情況調(diào)整曝光時(shí)間，重復(fù)壓片、顯影及定影，選擇滿意的膠片。 （5）重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
» 猜你喜歡
287求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
22408 344分 求調(diào)劑 一志愿 華電計(jì)算機(jī)技術(shù)
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
289求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
317求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
廣西大學(xué)家禽遺傳育種課題組2026年碩士招生（接收計(jì)算機(jī)專業(yè)調(diào)劑）
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
學(xué)校已經(jīng)提交到NSFC，還能修改嗎？
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
08工學(xué)調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
281求調(diào)劑（0805）
已經(jīng)有25人回復(fù)
-
085600材料與化工
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
265求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
千與千尋1
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1314.3
- 散金: 209
- 紅花: 5
- 帖子: 635
- 在線: 31小時(shí)
- 蟲號(hào): 4273206
- 注冊(cè): 2015-12-07
- 性別: MM
- 專業(yè): 作物雜種優(yōu)勢(shì)及其利用
2樓2016-12-15 15:46:10
zj90929
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 633.7
- 帖子: 59
- 在線: 25.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 3067023
- 注冊(cè): 2014-03-18
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
3樓2016-12-15 16:09:54
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 z妲妲 的主題更新
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 08工學(xué)調(diào)劑 +5 | 用戶573181 2026-03-20 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +8 | 梁梁校校 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 298-一志愿中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-求調(diào)劑 +9 | 手機(jī)用戶 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +9 | 梁梁校校 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11 | Ymlll 2026-03-18 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +4 | @taotao 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[論文投稿]
申請(qǐng)回稿延期一個(gè)月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時(shí)間沒變，給編輯又寫郵件了，沒回復(fù)
 10+3
|
wangf9518 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +10 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 14/700 |
|
|
|
[考博] 申博26年 +3 | 八6八68 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4 | 18889395102 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +10 | 慕寒mio 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑 +11 | yangfz 2026-03-17 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +5 | △小透明* 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +6 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡(jiǎn)單點(diǎn)0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +5 | 大米飯！ 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈工大材料324分求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-14 | 5/250 |
|