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自己總結(jié)的western操作步驟，簡單實用 已有2人參與
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自己總結(jié)的western操作步驟，簡單實用 1．制膠及上樣： （1）配制12%SDS-PAGE分離膠，混勻后注入邊條厚度為2mm的兩塊潔凈玻璃板間，其上加一薄層異丙醇，室溫下靜置至凝固。 （2）待分離膠完全聚合后，傾去其上的水層，以吸水紙吸凈殘余液體，插入加樣梳，緩緩加入濃縮膠，使其充滿加樣梳間的空隙，室溫下靜置。待膠完全聚合。 （3）將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩沖液。 （4）小心拔去加樣梳，使加樣孔豎直，以電泳緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。 （5）分別取50μg蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量Marker，按4：1體積比加入5′樣品緩沖液，以1′樣品緩沖液？配平上樣體積（總體積20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白變性。 （6）將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入分離膠的上樣孔中。 2．電泳 （1）接通凝膠電泳儀的電源，初始電壓70V。（約30分鐘） （2）溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至160V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠的下緣。（約60分鐘） 3．轉(zhuǎn)膜 （1）從玻璃板中取出凝膠，將其浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。 （2）取與膠同樣大小的硝酸纖維素膜，以95%乙醇浸泡5秒鐘后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液5分鐘以上待用。 （3）按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。 （4）將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，膜在正極、膠在負(fù)極，接冷卻循環(huán)水，90V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移2小時。 4．染色 （1）將硝酸纖維素浸入麗春紅使用液中，振搖染色5-10min。 （2）蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)后，用去離子水洗去硝酸纖維膜上的麗春紅底色。 （3）按照蛋白質(zhì)分子量Marker指示的位置剪下目的條帶所在的硝酸纖維素膜。 5．封閉 把硝酸纖維素膜浸入5%脫脂奶粉，室溫?fù)u動2小時。 6．洗膜與雜交 （1）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 （2）第一抗體封閉： SPARC單抗以T-TBS 1：200稀釋，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，4℃振搖過夜。 （3）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 （4）第二抗體封閉：辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，室溫下振搖60分鐘。 （5）以T-TBS洗膜，10分鐘′ 3次。 7．化學(xué)發(fā)光與曝光 （1）將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動孵育1分鐘。 （2）用濾紙沾干膜上的液體，用保鮮膜包好，用感光膠片在壓片盒中曝光約1分鐘。 （3）曝光后的感光膠片在顯影液中顯影約30秒鐘，定影液中定影1分鐘，用水沖洗后晾干。 （4）根據(jù)曝光情況調(diào)整曝光時間，重復(fù)壓片、顯影及定影，選擇滿意的膠片。 （5）重復(fù)實驗三次。 |
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2樓2016-12-15 15:46:10
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