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[求助]
重疊pcr問(wèn)題求大俠賜教 已有1人參與
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我在做重疊pcr時(shí)，遇到了以下問(wèn)題 1.mark跑出來(lái)不是很分散，可能是膠的問(wèn)題，具體原因不是很清楚，麻煩講下膠的注意事項(xiàng) 2.擴(kuò)增雜帶多，查資料講可能是重疊互補(bǔ)的片段與兩邊的引物退火溫度不一致，建議用特異性高的20bp序列作為重疊區(qū)，這樣會(huì)增加引物長(zhǎng)度，不會(huì)很貴嗎？如果可以，大家會(huì)這樣用嗎？ 3.pcrw體系配制除了重組酶和buffer都是統(tǒng)一配置分裝的，最后有2管沒(méi)p出來(lái)，p出了6管.是我的操作不過(guò)關(guān)嘛 我做的是三段重疊，分別為500.1200.500bp.新手問(wèn)題比較多，一樣對(duì)重疊pcr注意事項(xiàng)講詳細(xì)點(diǎn)，謝謝大俠！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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公式ug=（bp×pmol×660）/1000000，一個(gè)50ul的pcr反應(yīng)體系一般加引物10pmol左右，帶入之后500bp大概就是5ng的樣子。重疊pcr前面幾個(gè)循環(huán)就是把片段當(dāng)引物的，兩步法退火和延伸合并。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
19樓2016-11-14 23:36:55
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補(bǔ)充下，我做的三段都做了純化，然后按照師兄講的用片段濃度除以片段長(zhǎng)度算出后，定中片段為1微，算出上和下的體積，沒(méi)有先做10個(gè)循環(huán)，直接將酶引物都放入做的pcr. 做了四次，第一次成功了，切膠回收沒(méi)做對(duì)。失敗了兩次，都是沒(méi)有目的條帶，第四次有成功的也有沒(méi)有的，雜帶較多。確定引物酶都沒(méi)問(wèn)題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-11-13 10:38:28
3樓2016-11-13 10:45:06
小冀-
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【答案】應(yīng)助回帖
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膠的問(wèn)題的話重新陪就是了，不行換個(gè)濃度試試，引物的話花不了多少錢的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-11-13 12:24:52
5樓2016-11-13 22:52:57
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6樓2016-11-13 23:08:56
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1 膠的濃度是根據(jù)你的片段大小及目的用的。了解膠配置原理，你就知道哪里有問(wèn)題了2引物如果是自己設(shè)計(jì)的話不貴，一個(gè)堿基才兩塊錢不到一個(gè)OD，公司設(shè)計(jì)的就貴了3擴(kuò)增結(jié)果這個(gè)不好說(shuō)，就算是 平均分配到六管有的沒(méi)擴(kuò)出來(lái)的因素也很多。比如 管子質(zhì)量，機(jī)器加熱槽分布不均勻，混合液沒(méi)混勻等，都有可能，建議先一個(gè)個(gè)片段搞定，再去退火，而且每個(gè)片段純化。還有片段多的話，可以分開(kāi)鏈接，兩個(gè)兩個(gè)連，多了就不好了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2016-11-13 23:17:52
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是濃度比為1比1嗎？我們實(shí)驗(yàn)室的手冊(cè)上講加入的500bp的片段為0.05-5ng ，能說(shuō)明下是按照質(zhì)量比還是濃度比，另外bp數(shù)目不同，加入的量相同嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-11-14 10:21:47
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膠的注意事項(xiàng)我了解了，我們配的是1%的膠，范圍幾百到一萬(wàn)之間，倒膠之前一定要完全冷卻下來(lái)，不能太燙，另外倒的過(guò)程不能有氣泡，一下倒成，不能在其快要凝固了再往里加。待其凝固大概20分鐘，在含有EB的緩沖液浸泡30分鐘。 公司設(shè)計(jì)的引物，所以自己加重疊區(qū)就不可行了。 先將p出的片段純化，然后加入1.2片段，不加引物十個(gè)循環(huán)，再加1.4引物 p出后純化，再加入3片段，十個(gè)循環(huán)，加1.6片段，我的理解對(duì)嗎？另外加入的模板量怎么確定，樓上有人回答了 ，不太確定對(duì)不對(duì)，希望回答一下。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-11-14 10:29:42
10樓2016-11-14 10:30:57
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