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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 重疊pcr問題求大俠賜教
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[求助]
重疊pcr問題求大俠賜教 已有1人參與
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我在做重疊pcr時，遇到了以下問題 1.mark跑出來不是很分散，可能是膠的問題，具體原因不是很清楚，麻煩講下膠的注意事項 2.擴增雜帶多，查資料講可能是重疊互補的片段與兩邊的引物退火溫度不一致，建議用特異性高的20bp序列作為重疊區(qū)，這樣會增加引物長度，不會很貴嗎？如果可以，大家會這樣用嗎？ 3.pcrw體系配制除了重組酶和buffer都是統(tǒng)一配置分裝的，最后有2管沒p出來，p出了6管.是我的操作不過關嘛 我做的是三段重疊，分別為500.1200.500bp.新手問題比較多，一樣對重疊pcr注意事項講詳細點，謝謝大俠！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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膠的注意事項我了解了，我們配的是1%的膠，范圍幾百到一萬之間，倒膠之前一定要完全冷卻下來，不能太燙，另外倒的過程不能有氣泡，一下倒成，不能在其快要凝固了再往里加。待其凝固大概20分鐘，在含有EB的緩沖液浸泡30分鐘。 公司設計的引物，所以自己加重疊區(qū)就不可行了。 先將p出的片段純化，然后加入1.2片段，不加引物十個循環(huán)，再加1.4引物 p出后純化，再加入3片段，十個循環(huán)，加1.6片段，我的理解對嗎？另外加入的模板量怎么確定，樓上有人回答了 ，不太確定對不對，希望回答一下。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-11-14 10:29:42
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補充下，我做的三段都做了純化，然后按照師兄講的用片段濃度除以片段長度算出后，定中片段為1微，算出上和下的體積，沒有先做10個循環(huán)，直接將酶引物都放入做的pcr. 做了四次，第一次成功了，切膠回收沒做對。失敗了兩次，都是沒有目的條帶，第四次有成功的也有沒有的，雜帶較多。確定引物酶都沒問題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-11-13 10:38:28
3樓2016-11-13 10:45:06
小冀-
版主 (著名寫手)
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- 專業(yè): 生物信息學
- 管轄: 微生物
4樓2016-11-13 12:24:52
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