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興奮劑促紅細(xì)胞生成素免疫檢測(cè)方法的研究 已有1人參與
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1.抗人促紅細(xì)胞生成素單克隆抗體的制備復(fù)蘇抗rHuFPO雜交瘤細(xì)胞，采用動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法，大量制備腹水。用快速蛋白液相分析儀(FPLC)，聯(lián)合使用疏水柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱純化單克隆抗體。 2.單克隆抗體理化性質(zhì)及親和力的鑒定采用雙向免疫擴(kuò)散法、紫外分光光度計(jì)法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別測(cè)定單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞類、濃度和分子量。參照Beatty等人所建立的方法，尋求抗體與固定化抗原親和常數(shù)。確定抗體的工作濃度，并以此濃度，按照Friguet的方法選擇最合適的抗原包被量。作OD450nm與對(duì)數(shù)抗原稀釋度的關(guān)系曲線，求得液相親和常數(shù)。 3. 藻膽蛋白的制備、純化及性質(zhì)測(cè)定培養(yǎng)鈍頂螺旋藻，收集的鮮藻泥通過(guò)硫酸銨分級(jí)分離法得到藻膽蛋白的粗品。聯(lián)合使用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱和SephacrylS-200HR柱進(jìn)一步純化藻膽蛋白，得到的純品進(jìn)行分子量測(cè)定，并測(cè)定藻膽蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜。 4.單克隆抗體-藻膽蛋白熒光探針的制備5 mg PBP和5 μg SPDP依洪孝莊等人的方法進(jìn)行偶聯(lián)，制備單抗-藻膽蛋白的偶聯(lián)物。 5.競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法檢測(cè)血清EPO的含量以測(cè)定抗體與溶液中抗原的親和常數(shù)時(shí)所用抗體濃度作為抗體的工作濃度，并以其所用抗原包被量包被酶標(biāo)板。將含一定量rHuEPO的標(biāo)準(zhǔn)溶液按倍比稀釋與定量McAb溶液分別混合，室溫下溫育15 min后加入以rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，以EPO稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)(以2為底)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將正常人血清100 μ1與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)同樣量McAb混合，室溫下溫育15 min后加入與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)同樣量rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，同上操作，所測(cè)數(shù)據(jù)即為血清中EPO含量的OD值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。 6.熒光免疫法檢測(cè)血清中EPO的含量用McAb包被酶標(biāo)板，4℃冰箱過(guò)夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入對(duì)應(yīng)濃度為10-12～10-10 mol/L之間的一系列標(biāo)準(zhǔn)EPO溶液，與過(guò)量IgG-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過(guò)夜)37℃下保溫1 h，酶標(biāo)板用PBS-T洗滌(3×3 min)，加入熒光洗脫液100 μl/孔，50℃下溫育30 min。同一樣品做5孔。收集相同5孔內(nèi)的液體，HITACHIF-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光最大發(fā)射峰值對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。用McAb包被，4℃冰箱過(guò)夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入50 μl正常人血清樣品與過(guò)量IgG-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過(guò)夜)，以下操作同上，熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光最大發(fā)射峰值對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。 |
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2樓2017-01-03 17:44:42
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