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興奮劑促紅細胞生成素免疫檢測方法的研究 已有1人參與
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1.抗人促紅細胞生成素單克隆抗體的制備復(fù)蘇抗rHuFPO雜交瘤細胞，采用動物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法，大量制備腹水。用快速蛋白液相分析儀(FPLC)，聯(lián)合使用疏水柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱純化單克隆抗體。 2.單克隆抗體理化性質(zhì)及親和力的鑒定采用雙向免疫擴散法、紫外分光光度計法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別測定單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞類、濃度和分子量。參照Beatty等人所建立的方法，尋求抗體與固定化抗原親和常數(shù)。確定抗體的工作濃度，并以此濃度，按照Friguet的方法選擇最合適的抗原包被量。作OD450nm與對數(shù)抗原稀釋度的關(guān)系曲線，求得液相親和常數(shù)。 3. 藻膽蛋白的制備、純化及性質(zhì)測定培養(yǎng)鈍頂螺旋藻，收集的鮮藻泥通過硫酸銨分級分離法得到藻膽蛋白的粗品。聯(lián)合使用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱和SephacrylS-200HR柱進一步純化藻膽蛋白，得到的純品進行分子量測定，并測定藻膽蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜。 4.單克隆抗體-藻膽蛋白熒光探針的制備5 mg PBP和5 μg SPDP依洪孝莊等人的方法進行偶聯(lián)，制備單抗-藻膽蛋白的偶聯(lián)物。 5.競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法檢測血清EPO的含量以測定抗體與溶液中抗原的親和常數(shù)時所用抗體濃度作為抗體的工作濃度，并以其所用抗原包被量包被酶標(biāo)板。將含一定量rHuEPO的標(biāo)準(zhǔn)溶液按倍比稀釋與定量McAb溶液分別混合，室溫下溫育15 min后加入以rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，以EPO稀釋倍數(shù)的對數(shù)(以2為底)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將正常人血清100 μ1與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時同樣量McAb混合，室溫下溫育15 min后加入與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時同樣量rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，同上操作，所測數(shù)據(jù)即為血清中EPO含量的OD值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。 6.熒光免疫法檢測血清中EPO的含量用McAb包被酶標(biāo)板，4℃冰箱過夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入對應(yīng)濃度為10-12～10-10 mol/L之間的一系列標(biāo)準(zhǔn)EPO溶液，與過量IgG-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過夜)37℃下保溫1 h，酶標(biāo)板用PBS-T洗滌(3×3 min)，加入熒光洗脫液100 μl/孔，50℃下溫育30 min。同一樣品做5孔。收集相同5孔內(nèi)的液體，HITACHIF-4500熒光分光光度計測熒光最大發(fā)射峰值對應(yīng)的熒光強度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。用McAb包被，4℃冰箱過夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入50 μl正常人血清樣品與過量IgG-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過夜)，以下操作同上，熒光分光光度計測熒光最大發(fā)射峰值對應(yīng)的熒光強度后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。 |
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2樓2017-01-03 17:44:42
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