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WilliamHJ金蟲 (小有名氣)
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[求助]
pSC101質(zhì)粒在BL21（DE3）能正常復(fù)制嗎？ 已有2人參與
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如題，樓主最近構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)粒，大小約14000bp。這個(gè)質(zhì)粒用的是PSC101質(zhì)粒的復(fù)制子（pSC101 ori +Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp長(zhǎng)），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因區(qū)（長(zhǎng)度約1100bp），剩下的序列主要是是色氨酸操縱子序列（約11500bp，還包括另外兩個(gè)和色氨酸合成有關(guān)的基因）。用Gibson重組做好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入全式金的Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑出陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)菌液PCR和測(cè)序都是對(duì)的，帶質(zhì)粒的T1細(xì)胞在100ug/mL的Amp抗性平板上生長(zhǎng)良好。但是用提出來(lái)的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化100uL BL21（DE3）感受態(tài)時(shí)卻一個(gè)點(diǎn)都長(zhǎng)不出來(lái)。 BL21（DE3）感受態(tài)是自己做的，而且這個(gè)菌種樓主之前用Kana基因代替了核DNA上的色氨酸酶基因（tnaA），當(dāng)天做好感受態(tài)就用來(lái)做轉(zhuǎn)化，同時(shí)做了一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)化（帶trp操縱子的PBR322質(zhì)粒，也有14000bp）。提取的質(zhì)粒做過(guò)檢測(cè)，40ng/ul左右，轉(zhuǎn)了2uL。對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)了1ul（200ng）。兩管感受態(tài)都是冰浴30min后42度熱激60s，加入900ul的 LB在37度復(fù)蘇1小時(shí)，取200ul涂板。對(duì)照長(zhǎng)出來(lái)滿板，但是重組質(zhì)粒一個(gè)點(diǎn)都沒(méi)長(zhǎng)出來(lái)。樓主之前用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化W3110就能長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆，但是轉(zhuǎn)化子比較少。 請(qǐng)各位蟲友幫樓主分析分析是什么原因，是不是pSC101復(fù)制子不適合帶這么長(zhǎng)的片段，還是說(shuō)在BL21里需要特殊的處理？ |
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4樓2017-05-22 11:02:51
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5樓2017-05-23 08:45:39
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6樓2017-12-21 17:06:58
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8樓2018-08-21 13:32:58
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