 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5652 | 回復(fù): 7 | ||
WilliamHJ金蟲 (小有名氣)
|
[求助]
pSC101質(zhì)粒在BL21（DE3）能正常復(fù)制嗎？ 已有2人參與
|
|
如題，樓主最近構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)粒，大小約14000bp。這個(gè)質(zhì)粒用的是PSC101質(zhì)粒的復(fù)制子（pSC101 ori +Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp長(zhǎng)），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因區(qū)（長(zhǎng)度約1100bp），剩下的序列主要是是色氨酸操縱子序列（約11500bp，還包括另外兩個(gè)和色氨酸合成有關(guān)的基因）。用Gibson重組做好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入全式金的Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑出陽(yáng)性克隆經(jīng)過菌液PCR和測(cè)序都是對(duì)的，帶質(zhì)粒的T1細(xì)胞在100ug/mL的Amp抗性平板上生長(zhǎng)良好。但是用提出來的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化100uL BL21（DE3）感受態(tài)時(shí)卻一個(gè)點(diǎn)都長(zhǎng)不出來。 BL21（DE3）感受態(tài)是自己做的，而且這個(gè)菌種樓主之前用Kana基因代替了核DNA上的色氨酸酶基因（tnaA），當(dāng)天做好感受態(tài)就用來做轉(zhuǎn)化，同時(shí)做了一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)化（帶trp操縱子的PBR322質(zhì)粒，也有14000bp）。提取的質(zhì)粒做過檢測(cè)，40ng/ul左右，轉(zhuǎn)了2uL。對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)了1ul（200ng）。兩管感受態(tài)都是冰浴30min后42度熱激60s，加入900ul的 LB在37度復(fù)蘇1小時(shí)，取200ul涂板。對(duì)照長(zhǎng)出來滿板，但是重組質(zhì)粒一個(gè)點(diǎn)都沒長(zhǎng)出來。樓主之前用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化W3110就能長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆，但是轉(zhuǎn)化子比較少。 請(qǐng)各位蟲友幫樓主分析分析是什么原因，是不是pSC101復(fù)制子不適合帶這么長(zhǎng)的片段，還是說在BL21里需要特殊的處理？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有166人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
WilliamHJ
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2186.9
- 紅花: 5
- 帖子: 170
- 在線: 58.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1858225
- 注冊(cè): 2012-06-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2016-12-14 14:35:04
WilliamHJ3樓2017-02-16 10:50:51
qiannianchao
金蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1102.3
- 帖子: 15
- 在線: 85.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 1183662
- 注冊(cè): 2011-01-05
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
4樓2017-05-22 11:02:51
WilliamHJ
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2186.9
- 紅花: 5
- 帖子: 170
- 在線: 58.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1858225
- 注冊(cè): 2012-06-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
5樓2017-05-23 08:45:39
WilliamHJ
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2186.9
- 紅花: 5
- 帖子: 170
- 在線: 58.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1858225
- 注冊(cè): 2012-06-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
6樓2017-12-21 17:06:58
Delia叮叮
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 15
- 帖子: 3
- 在線: 9.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 3498118
- 注冊(cè): 2014-10-25
- 專業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
7樓2018-04-15 23:41:57
流水不爭(zhēng)
鐵桿木蟲 (正式寫手)
小木蟲
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 7336.6
- 散金: 48
- 紅花: 4
- 帖子: 830
- 在線: 436.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 2338741
- 注冊(cè): 2013-03-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學(xué)
8樓2018-08-21 13:32:58
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 WilliamHJ 的主題更新
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿山大07化學(xué) 332分 四六級(jí)已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-16 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)，080502，354分求調(diào)劑 +5 | 守候夕陽(yáng)CF 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 【考研調(diào)劑】化學(xué)專業(yè) 281分，一志愿四川大學(xué)，誠(chéng)心求調(diào)劑 +8 | 吃吃吃才有意義 2026-03-19 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿華南師大 070300（化學(xué)）304分求調(diào)劑 +3 | 0703武芊慧雪304 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交大，求調(diào)劑 +5 | 材化逐夢(mèng)人 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +5 | 申子申申 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +7 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +4 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 350求調(diào)劑 +5 | weudhdk 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +7 | ^O^乜 2026-03-19 | 7/350 |
|
|
|
[考研] A區(qū)線材料學(xué)調(diào)劑 +5 | 周周無極 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +12 | 梁梁校校 2026-03-19 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 一志愿西安交通大學(xué) 學(xué)碩 354求調(diào)劑 +3 | 我想要讀研究生 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11 | Ymlll 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國(guó)海洋大學(xué)，生物學(xué)，301分，求調(diào)劑 +5 | 1孫悟空 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | z1z2z3879 2026-03-14 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 070305求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程315分求調(diào)劑 +3 | yang_0104 2026-03-15 | 3/150 |
|