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[求助]
酶切驗(yàn)證 已有4人參與
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各位前輩，做酶切驗(yàn)證2月有余，一直切不開苦于不知道什么原因，特來(lái)求助。如圖是，最新一次華大合成嗯引物，泳道5是marker.6是ApaI單酶切條帶，7是KpnI單酶切條帶，8是APAI和KPNI雙酶切的條帶。目的基因大小應(yīng)為3301，T載體是2692。加起來(lái)質(zhì)粒應(yīng)為6000左右。三次合成帶酶切位點(diǎn)的引物pcr都能擴(kuò)增出條帶，但是提取的質(zhì)粒大小也對(duì)，唯獨(dú)切不開。請(qǐng)各位前輩幫忙分析一下是否是酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)有問(wèn)題，還是合成過(guò)程突變或者甲基化了。另外，酶切體系是：10*buffer 2ul, apaI1ul,kpnI1ul ,質(zhì)粒5 ul,ddh2 o 11ul.37°，2h 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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sky蒲公英
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-26 07:42:37
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質(zhì)粒做pcr了嗎？如果質(zhì)粒pcr擴(kuò)出來(lái)，酶切時(shí)間可以相應(yīng)的增長(zhǎng)些，過(guò)夜切�；蛘咴僬颐盖形稽c(diǎn)，換一個(gè)酶進(jìn)行單酶切。以前碰到過(guò)這種情況，剛開始沒(méi)有切開，后來(lái)過(guò)夜切就切開了，測(cè)序也對(duì)。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-12-25 13:18:19
mlxmiao
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3樓2016-12-25 10:18:55
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-26 07:42:54
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7樓2016-12-25 16:06:15
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8樓2016-12-25 16:14:53
yujiaping1
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同意7樓觀點(diǎn)，明顯ApaI是切出兩條帶。你現(xiàn)在具體的實(shí)驗(yàn)，是不是先擴(kuò)增，然后使用TA克隆導(dǎo)入載體，然后雙酶切，你這種情況要排出序列和載體中均沒(méi)有ApaI位點(diǎn)，不知道你是怎么做的？再者，你這個(gè)圖要跑一個(gè)沒(méi)有酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照，這樣更有利于判斷你單酶切的效果。最后還有一點(diǎn)你需要注意，每個(gè)酶的工作buffer是不同的，需要查一下說(shuō)明書，看一下是否在你選用的buffer中兩個(gè)酶的活性都很好，比如說(shuō)NEB的酶，cutsmart buffer適合很多種酶，但也有沒(méi)有活性的。所以方方面面都要考慮到。最后給個(gè)建議，轉(zhuǎn)入T載體再酶切其實(shí)沒(méi)必要，在引物上直接加上保護(hù)堿基，直接雙酶切，直接往表達(dá)載體上連吧，省去TA克隆，還能省點(diǎn)時(shí)間。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
11樓2016-12-25 21:27:14
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13樓2016-12-26 02:49:26
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14樓2016-12-26 09:58:58
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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按照你說(shuō)的，6是ApaI單酶切條帶，7是KpnI單酶切條帶，8是APAI和KPNI雙酶切的條帶。那么兩個(gè)單酶切條帶都不一樣大，第一個(gè)考慮酶切位點(diǎn)不止一個(gè)(樓上已經(jīng)提到過(guò)了)，第二一個(gè)就是pcr擴(kuò)增的時(shí)候有突變，第三個(gè)就是你最好加一個(gè)質(zhì)粒的對(duì)照，到底切沒(méi)切開一看就知道了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
18樓2016-12-26 14:30:30
sky蒲公英
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2樓2016-12-25 09:35:05
4樓2016-12-25 13:12:41
質(zhì)粒pcr是對(duì)的。曾經(jīng)前兩次合成的引物也是切不開，后來(lái)送出去測(cè)序發(fā)現(xiàn)合成錯(cuò)了。所以這次換了個(gè)公司合成，還是這種情況。所以，覺(jué)得可能不是合成的問(wèn)題，所以來(lái)請(qǐng)教前輩們。我之前試著切過(guò)5個(gè)小時(shí)，也沒(méi)有切開。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-12-25 14:45:12
9樓2016-12-25 18:05:51
10樓2016-12-25 18:07:07
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