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qs8lhy86新蟲 (初入文壇)
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[交流]
Ni-NTA親和層析純化蛋白的問題（不掛柱�。�
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我的目的蛋白大小在29KDA左右，連接質(zhì)粒用的是PET28a，雙酶切用的是Bam HI 和Hind Ⅲ，誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要在上清中(圖一)，做Ni柱親和層析用的binding buffer含10mM咪唑，洗脫液分別用 50、100、250mM咪唑，電泳圖（圖二）顯示蛋白并沒有洗脫下來，而在最開始的10mM咪唑時(shí)似乎就已經(jīng)洗脫下來了（最右條帶）。 問題一:圖二的電泳圖是否說明我的目的蛋白與Ni柱沒有結(jié)合上或者結(jié)合的很弱？我想的解決辦法是把Ni-NTA resin先與蛋白混合，孵育一段時(shí)間再上柱，是否可行？ 問題二:用PET 28a和Bam HI和Hind Ⅲ雙酶切，我的目的蛋白一定會(huì)帶上HIS標(biāo)簽嗎？我擔(dān)心可能是HIS標(biāo)簽被包埋，根據(jù)蛋白的分子量(29KDA)有這種可能嗎？我想的解決辦法是處理蛋白時(shí)binding buffer和elution buffer 都加8M的尿素，但我的是上清不是包涵體，這樣是否可行？ 問題三:處理蛋白時(shí)我加的binding buffer含有10mM咪唑，是否影響目的蛋白與Ni2+ 的結(jié)合？ 我很困惑，請(qǐng)高人幫我分析原因和建議。感謝！ 圖一 圖二 |
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2樓2016-12-29 17:15:55
3樓2016-12-29 17:17:00
qs8lhy86
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4樓2016-12-29 21:31:11
氺澤兮木蘭
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應(yīng)該可以結(jié)合一段時(shí)間在上柱。如果不是包涵體蛋白，應(yīng)該沒有必要用8M尿素處理吧。初始低濃度咪唑可以用來洗雜蛋白，應(yīng)該是不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的結(jié)合的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-02-08 16:46:29
小樹懶很好
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6樓2021-04-19 00:06:52
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