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[交流]
Ni-NTA親和層析純化蛋白的問題（不掛柱�。�
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我的目的蛋白大小在29KDA左右，連接質粒用的是PET28a，雙酶切用的是Bam HI 和Hind Ⅲ，誘導表達后發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要在上清中(圖一)，做Ni柱親和層析用的binding buffer含10mM咪唑，洗脫液分別用 50、100、250mM咪唑，電泳圖（圖二）顯示蛋白并沒有洗脫下來，而在最開始的10mM咪唑時似乎就已經(jīng)洗脫下來了（最右條帶）。 問題一:圖二的電泳圖是否說明我的目的蛋白與Ni柱沒有結合上或者結合的很弱？我想的解決辦法是把Ni-NTA resin先與蛋白混合，孵育一段時間再上柱，是否可行？ 問題二:用PET 28a和Bam HI和Hind Ⅲ雙酶切，我的目的蛋白一定會帶上HIS標簽嗎？我擔心可能是HIS標簽被包埋，根據(jù)蛋白的分子量(29KDA)有這種可能嗎？我想的解決辦法是處理蛋白時binding buffer和elution buffer 都加8M的尿素，但我的是上清不是包涵體，這樣是否可行？ 問題三:處理蛋白時我加的binding buffer含有10mM咪唑，是否影響目的蛋白與Ni2+ 的結合？ 我很困惑，請高人幫我分析原因和建議。感謝！ 圖一 圖二 |
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3樓2016-12-29 17:17:00
2樓2016-12-29 17:15:55
4樓2016-12-29 21:31:11
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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應該可以結合一段時間在上柱。如果不是包涵體蛋白，應該沒有必要用8M尿素處理吧。初始低濃度咪唑可以用來洗雜蛋白，應該是不會影響目標蛋白的結合的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-02-08 16:46:29
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