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winehappyue新蟲 (初入文壇)
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[交流]
反轉(zhuǎn)錄后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的cDNA含內(nèi)含子 已有5人參與
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求各位大神幫忙�。�！ 反轉(zhuǎn)錄PCR后，發(fā)現(xiàn)目的條帶中含有一段100bp左右的內(nèi)含子序列！ 現(xiàn)懷疑是提RNA時(shí)DNA沒(méi)有消化完全。 求問(wèn)是否可以在得到的RNA中直接加入DNA消化酶，再反轉(zhuǎn)？如果可以，有推薦的產(chǎn)品么，加入量是多少？ |
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可以，但是消化完基因組DNA后，還要把rna再抽提一遍，去除里面的酶，鹽離子等等。用dna酶I，具體用量看說(shuō)明書就行了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-12-30 22:38:06
winehappyue
新蟲 (初入文壇)
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3樓2017-01-02 10:16:14
4樓2017-01-02 10:53:47
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另外，消化完后，抽提的時(shí)候要在體系里面補(bǔ)幾百微升的無(wú)rna酶的滅菌雙蒸水。 還要注意保持低溫，不要讓rna降解了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-01-02 10:57:50
小冀-
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6樓2017-02-21 19:03:40
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7樓2017-02-21 22:11:51
winyuyuyu123
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首先，你做RT用的是什么，有的RT試劑盒里面直接包含DNase的，有的沒(méi)有；沒(méi)有的話就需要自行消解，一般用RQ1即可。你可以將自己的RNA先跑個(gè)電泳，上樣量300ng即可，看看有沒(méi)有明顯的基因組條帶。 自行用RQ1消解的話，可以先將你所有的樣品都拿來(lái)消解，然后純化，然后取1-2μg做RT；也可以直接取1-2μg做消解，然后把消解產(chǎn)物直接RT。 最后提醒一點(diǎn)，確定你的序列信息，包含內(nèi)含子的具體情況是什么樣的，是不是有可能發(fā)生的As事件，如果是，沒(méi)準(zhǔn)又可以出一篇文章。。 |
8樓2017-02-22 09:43:35
2220360280
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9樓2017-04-21 18:34:36
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