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基因敲除過程中的質粒驗證問題。
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本人最近在做一株蠟樣芽胞桿菌敲除，使用溫敏型質粒，帶有氯霉素抗性。電轉化。 基本情況是這樣的： 1 已經反復確認了原生菌沒有氯霉素抗性，轉化后的菌株可以在氯霉素的液體中穩(wěn)定傳代。轉化后菌株菌落形態(tài)與原生菌一致，16s鑒定完全一致，基本排除是雜菌的可能性。 2 菌液pcr正確。使用了構建同源臂時的引物，得到正確條帶。 疑點：一直都提不出質粒，試過好多次。試過單獨溶菌酶（溶于溶菌酶緩沖液）先處理后再提質粒的試劑盒，也試過直接將溶菌酶溶于solution1 后37℃水浴30分鐘。溶菌酶濃度試過2mg/ml-25mg/ml不等。 每次提出質粒測濃度有100-200ng/ul，純度良好 260/230在1.8左右，260/280在2.0左右。 但是每次跑電泳及單雙酶切均得不到條帶或者得到多條不正確雜帶。但是我構建好的重組質粒為陽性對照一起點樣時正確的。所以電泳及酶應該沒有問題；而且溶菌酶應該也沒有問題，最近用它提取陽性菌的基因組得到的基因組濃度很高。 附件附上兩次跑質粒以及單雙酶切的結果。提取了三個菌落加入氯霉素擴大培養(yǎng)后的質粒，培養(yǎng)時間12-13小時。 左側是跑質粒，右側是單雙酶切，左側從左到右分別是三個樣品的質粒，環(huán)形marker，原生質粒（有一幅圖沒有這個對照），重組質粒陽性對照。 右側是每個樣品的單酶切，單酶切，雙酶切，marker，還有原生質粒與 重組質粒的單雙酶切。 寫的很多很亂，但是很希望有高手個解答一下，轉化好多次結果都是這樣，快一年了  金幣不多，已經是全部了 急求高手~~~~~不勝感激161223重組菌提質粒單雙酶切及 pksv7-ud酶切1.jpg 161222重組菌提質粒單雙酶切及 pksv7，pksv7-ud酶切.jpg |
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科學小覃
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3樓2017-01-02 00:12:03
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