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基因敲除過程中的質(zhì)粒驗(yàn)證問題。
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本人最近在做一株蠟樣芽胞桿菌敲除，使用溫敏型質(zhì)粒，帶有氯霉素抗性。電轉(zhuǎn)化。 基本情況是這樣的： 1 已經(jīng)反復(fù)確認(rèn)了原生菌沒有氯霉素抗性，轉(zhuǎn)化后的菌株可以在氯霉素的液體中穩(wěn)定傳代。轉(zhuǎn)化后菌株菌落形態(tài)與原生菌一致，16s鑒定完全一致，基本排除是雜菌的可能性。 2 菌液pcr正確。使用了構(gòu)建同源臂時的引物，得到正確條帶。 疑點(diǎn)：一直都提不出質(zhì)粒，試過好多次。試過單獨(dú)溶菌酶（溶于溶菌酶緩沖液）先處理后再提質(zhì)粒的試劑盒，也試過直接將溶菌酶溶于solution1 后37℃水浴30分鐘。溶菌酶濃度試過2mg/ml-25mg/ml不等。 每次提出質(zhì)粒測濃度有100-200ng/ul，純度良好 260/230在1.8左右，260/280在2.0左右。 但是每次跑電泳及單雙酶切均得不到條帶或者得到多條不正確雜帶。但是我構(gòu)建好的重組質(zhì)粒為陽性對照一起點(diǎn)樣時正確的。所以電泳及酶應(yīng)該沒有問題；而且溶菌酶應(yīng)該也沒有問題，最近用它提取陽性菌的基因組得到的基因組濃度很高。 附件附上兩次跑質(zhì)粒以及單雙酶切的結(jié)果。提取了三個菌落加入氯霉素?cái)U(kuò)大培養(yǎng)后的質(zhì)粒，培養(yǎng)時間12-13小時。 左側(cè)是跑質(zhì)粒，右側(cè)是單雙酶切，左側(cè)從左到右分別是三個樣品的質(zhì)粒，環(huán)形marker，原生質(zhì)粒（有一幅圖沒有這個對照），重組質(zhì)粒陽性對照。 右側(cè)是每個樣品的單酶切，單酶切，雙酶切，marker，還有原生質(zhì)粒與 重組質(zhì)粒的單雙酶切。 寫的很多很亂，但是很希望有高手個解答一下，轉(zhuǎn)化好多次結(jié)果都是這樣，快一年了  金幣不多，已經(jīng)是全部了 急求高手~~~~~不勝感激161223重組菌提質(zhì)粒單雙酶切及 pksv7-ud酶切1.jpg 161222重組菌提質(zhì)粒單雙酶切及 pksv7，pksv7-ud酶切.jpg |
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chenjunpku
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
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同意樓上，沒必要驗(yàn)證芽孢桿菌中有沒有質(zhì)粒，只要敲除區(qū)PCR驗(yàn)證加表型變化這兩個數(shù)據(jù)就夠了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-01-02 00:12:03
科學(xué)小覃
木蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
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沒看明白樓主的意思，從蠟樣芽胞桿菌里提質(zhì)粒的用意是什么�？礃侵鞯拿枋龊孟袷怯猛粗亟M雙交換的方法進(jìn)行基因敲除，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蠟樣芽胞桿菌后，正常的思路是先進(jìn)行單交換的驗(yàn)證篩選，然后是雙交換的驗(yàn)證篩選，雙交換菌株即為基因敲除菌株。質(zhì)粒是在轉(zhuǎn)化蠟樣芽胞桿菌前酶切或測序驗(yàn)證已經(jīng)完成的工作，而樓主在轉(zhuǎn)化之后提取，這就看不懂了。 再者蠟樣芽胞桿菌與實(shí)驗(yàn)室的大腸桿菌不同，質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)去后有可能會被甲基化修飾，影響酶切；另外樓主用這種方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒的完整性、純度都不怎么好，再進(jìn)行酶切結(jié)果自然也不會好。 個人觀點(diǎn)，說的不對可以忽略 |
2樓2016-12-31 09:24:15
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