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Nigori

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[交流] 腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 已有1人參與

實(shí)驗(yàn)方法原理

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。

濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。

鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇 25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng) 72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計(jì)穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。

在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過變形運(yùn)動(dòng)穿過濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。

實(shí)驗(yàn)材料 Matrigel 基質(zhì)膠

試劑、試劑盒：DMEM、結(jié)晶紫染料溶液、醋酸、低血清DMEM培養(yǎng)基、FBS-DMEM培養(yǎng)基、IFN-γ

儀器、耗材：24-transwell (Coster)、離心管、冰箱、離心機(jī)、移液槍、槍頭、槍頭盒

實(shí)驗(yàn)步驟

一、溶液配制

1. DMEM

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml）

（2）母液0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml ；過濾消毒，-20℃保存。

2. NE-DMEM（-6 M）

NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

DMEM UP TO 100 ml

過濾消毒，4℃保存

3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）CGRP-儲(chǔ)存液 50 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）過濾消毒，4℃保存

4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）IFN-γ（25ng/μl） 25 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）過濾消毒，4℃保存。

5. 低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）

6. 20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）

7. Matrigel 基質(zhì)膠

（1）10 mg/ml，5 ml，分裝成0.5 ml/只10個(gè)EP管中。

（2）用時(shí)加入0.5 ml的DMEM。

（3）Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。

二、準(zhǔn)備

1. 溶膠，4℃過夜。

2. 室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。

三、包被基底膜（冰上操作）

1. 用無血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠。

2. 取100 ul稀釋膠加到24-well transwell上室中。

3. 37℃孵育transwell至少4-5 h 。

四、水化基底膜

1. 用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠。

五、準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室

1. 消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞。

2. 用培養(yǎng)基洗3遍。

3. 重懸細(xì)胞，5×105 cells/ml，1% FBS 。

4. 上室加200 ul細(xì)胞懸液。

5. 下室中加入600 ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族。

六、孵育

37℃，20 to 24 h 。

七、染色和計(jì)數(shù)

1. 棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞。

2. 移去transwells，倒置，風(fēng)干。

3. 24孔板中加入500 μl含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。

4. 直徑上取4個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。

5. 24孔板中加入500 μl 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。

注意事項(xiàng)

1. 照相前一定要晾干，照相時(shí)將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。

2. 使用 Matrivgel前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），避免反復(fù)凍融。

3. 使用時(shí)需接觸 Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃。

4. 使用 Matrivgel時(shí)注意無菌操作。

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1樓 2017-01-05 18:16:56

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2樓2018-06-04 16:21:15

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