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腫瘤細(xì)胞侵襲試驗 已有1人參與
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實(shí)驗方法原理 Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。 濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。 鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運(yùn)動。細(xì)胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇 25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng) 72小時后，有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。 在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過變形運(yùn)動穿過濾膜，用這種模型對分析細(xì)胞運(yùn)動能力和藥物對細(xì)胞運(yùn)動能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。 實(shí)驗材料 Matrigel 基質(zhì)膠 試劑、試劑盒：DMEM、結(jié)晶紫染料溶液、醋酸、低血清DMEM培養(yǎng)基、FBS-DMEM培養(yǎng)基、IFN-γ 儀器、耗材：24-transwell (Coster)、離心管、冰箱、離心機(jī)、移液槍、槍頭、槍頭盒 實(shí)驗步驟 一、溶液配制 1. DMEM （1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） （2）母液0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml ；過濾消毒，-20℃保存。 2. NE-DMEM（-6 M） NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl DMEM UP TO 100 ml 過濾消毒，4℃保存 3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng） （1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl （2）CGRP-儲存液 50 μl （3）DMEM UP TO 100 ml （4）過濾消毒，4℃保存 4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng） （1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl （2）IFN-γ（25ng/μl） 25 μl （3）DMEM UP TO 100 ml （4）過濾消毒，4℃保存。 5. 低血清DMEM培養(yǎng)基（上室） 6. 20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室） 7. Matrigel 基質(zhì)膠 （1）10 mg/ml，5 ml，分裝成0.5 ml/只10個EP管中。 （2）用時加入0.5 ml的DMEM。 （3）Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時可迅速凝結(jié)成膠。 二 、 準(zhǔn)備 1. 溶膠，4℃過夜。 2. 室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗前-20C預(yù)冷。 三、 包被基底膜（冰上操作） 1. 用無血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠。 2. 取100 ul稀釋膠加到24-well transwell上室中。 3. 37℃孵育transwell至少4-5 h 。 四、 水化基底膜 1. 用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠 。 五 、 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室 1. 消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞。 2. 用培養(yǎng)基洗3遍。 3. 重懸細(xì)胞，5×105 cells/ml，1% FBS 。 4. 上室加200 ul細(xì)胞懸液。 5. 下室中加入600 ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族。 六 、 孵育 37℃，20 to 24 h 。 七 、 染色和計數(shù) 1. 棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞。 2. 移去transwells，倒置，風(fēng)干。 3. 24孔板中加入500 μl含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。 4. 直徑上取4個視野，照相，計數(shù)。 5. 24孔板中加入500 μl 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。 注意事項 1. 照相前一定要晾干，照相時將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。 2. 使用 Matrivgel前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），避免反復(fù)凍融。 3. 使用時需接觸 Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃。 4. 使用 Matrivgel時注意無菌操作。 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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2樓2018-06-04 16:21:15
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