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upwardkl新蟲 (初入文壇)
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[求助]
LB平板培養(yǎng)大腸桿菌，不長菌，或零星幾個 已有5人參與
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近一個多月以來，自制的感受態(tài)細胞（Top10和DH5&）,測OD600值，均為0.5左右， 后將T-A克隆的產(chǎn)物做轉(zhuǎn)化，使用的平板為LB固體平板，平板涂布，37度培養(yǎng)，至少要等14-16h后，才能看到零星的菌，且特小，有時候甚至沒有菌，， 尋求原因和實驗指導(dǎo)和幫助！ 謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵熱心回帖交流 2017-03-05 08:54:53
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可以試著測以下感受態(tài)的效價，或者直接買個感受態(tài)，我用的是諾維贊家的，價格便宜，用的也不錯 感受態(tài)測效價方法是：轉(zhuǎn)1ng高質(zhì)量的質(zhì)粒到100μl感受態(tài)中 ——> 按克隆轉(zhuǎn)化流程：冰上靜置、熱激、冰冷、補培養(yǎng)基、搖菌 ——> 取1/10涂板，培養(yǎng)過夜 ——> 長1000個單菌落，效價為10^7 舉例子： 假設(shè)取0.1ng pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入100μl待測的感受態(tài)細菌中，按常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進行冰浴和熱擊，加入900μlSOC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（此時DNA濃度為0.1ng DNA/ml，這里也可使用LB培養(yǎng)基，但最后得到的克隆菌的數(shù)目可能會降低）。然后再用SOC培養(yǎng)基進行1:10稀釋（此時DNA濃度變?yōu)?.01ng DNA/ml），分別取100μl（含總量為0.001ng的DNA）涂布至兩個平行的平板中。如果最后產(chǎn)生的菌落數(shù)為200 個（兩個平板菌落的平均數(shù)），則轉(zhuǎn)化效率為： 200 cfu/0.001ng = 2×10^8 cfu/μg |
7樓2017-01-11 10:34:27
wskisaac
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建議先從公司買商業(yè)感受態(tài)，以此為基礎(chǔ)做自己感受態(tài)。OD最好0.3-0.4最好。先陽轉(zhuǎn)質(zhì)粒試試，別先做克隆。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
upwardkl9樓2017-01-11 15:52:07
2樓2017-01-10 16:09:36
4樓2017-01-10 21:29:16
010308Jing
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5樓2017-01-10 21:43:13
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8樓2017-01-11 15:25:10
wskisaac
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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就用一般的氯化鈣方法做就好，網(wǎng)上很多，一查就知道。關(guān)鍵是菌不要長過了，和氯化鈣要純。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
12樓2017-01-12 07:51:52
13樓2017-01-12 09:55:08
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3樓2017-01-10 20:37:23
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10樓2017-01-11 16:40:05
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