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麗姐萍妹新蟲 (正式寫手)
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[求助]
載體構(gòu)建 已有1人參與
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我準(zhǔn)備將載體中的GUS切掉 插入我的目的片段 可是GUS前后的雙切酶把我的載體切成了好幾個(gè)片段 后期準(zhǔn)備選用單酶切 用Pml1酶進(jìn)行單酶切 可是我的片段插入到GUS的后面 表達(dá)的問題怎么解決��？我的目的片段有起始密碼子和終止密碼子，這個(gè)要怎么處理啊 目的片段上的起始密碼子需要去掉嗎？還有GUS上的密碼子呢？不懂啊 實(shí)驗(yàn)小白 對(duì)于這塊不太清楚呢 求助！ @biostar2009 @飛約瘋?cè)嗽?/u> @wizardfan @youlinglyw 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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jurkat.1640
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2樓2017-02-08 17:18:45
yudaoqian88
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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樓主應(yīng)該是想超表達(dá)你的基因吧？ 前面說用載體gus前后的內(nèi)切酶切的很亂，可能是你的質(zhì)粒發(fā)生了變化，樓主可以劃線純化質(zhì)粒，多挑幾個(gè)菌落提取質(zhì)粒，做雙切看是否有對(duì)的。或者從別人或別的課題要這個(gè)載體用。 再者，超表達(dá)的載體很多，不妨更換載體，避開這個(gè)問題，比你慢慢找答案快的多。 還有，一些短的標(biāo)簽是可以放到基因的兩端的，gus我還不確定是否可以，因?yàn)樗_實(shí)好大。不知道是否妨礙目的基因的功能。如果放的話，只要保證前面的基因去掉終止密碼子，且不會(huì)造成后面基因發(fā)生移碼，不會(huì)提前出現(xiàn)終止子便可。 最后，樓主早看看單酶切插入片段的方向是否和啟動(dòng)子是順著的，反了也不行。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-02-09 01:08:14
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可能你剛開始就沒有分析載體的酶切位點(diǎn)，所以雙酶切切出很多條帶，如果這樣，可以保證GUS后酶切位點(diǎn)為PmL1酶，且為單位點(diǎn)，過表達(dá)或沉默基因最好插入GUS前面，插入后面也不是不可以，但是不能夠保證基因表達(dá)或者沉默，如果GUS前只有一個(gè)酶切位點(diǎn)能夠選擇，那就只能這樣了，不用去除GUS終止密碼子。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-02-09 01:33:22
麗姐萍妹
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我在做之前有分析酶切位點(diǎn)的 因?yàn)橛玫妮d體是優(yōu)化過的了 所以具體序列我是不知道的 大體的我有分析過酶切位點(diǎn)的 那如果GUS后面插入目的片段不能表達(dá)的話 插入也沒用啊 密碼子不需要去除的嗎？有沒有做雙價(jià)載體的啊 我是做植物的 你們是用什么載體呢？公司有賣嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-02-09 23:01:24
麗姐萍妹
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6樓2017-02-09 23:02:54
7樓2017-02-09 23:20:07
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