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wuqianqian新蟲 (初入文壇)
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[求助]
新設計的引物怎么都p不出來 已有4人參與
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新設計引物跑PCR失敗，我的流程是95℃ 5min,95℃ 50s,50度30s,72℃1min循環(huán)60次，72℃最后延伸10min,摸了50℃ 54℃ 56℃都失敗了，我的目的片段是1000bp，求解啊，希望各位大神能指導一下，謝謝！ @biostar2009 @飛約瘋?cè)嗽?/u> @youlinglyw @wizardfan 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
| p不出來有很多因素，1你用的模板是什么是質(zhì)粒還是基因組DNA，2加入模板的量的多少，過多或過少都會影響成功率，具體可以參照你使用的酶的說明書，3退火溫度可以參照TM值，但是不是絕對的，常用溫度50-60，有時40幾度也可以出條帶，4目標條帶1kb，延伸72度時可以放寬時間稍微長一點兒1min10sec或更長，因為說明書寫1kb／min，那是理論參考，實際操作可以加長一些，5引物是否保證正確，反向引物容易出錯，可以添加一陽性對照，用此引物肯定能p出條帶的，來確保反應體系沒問題，6循環(huán)數(shù)一般沒必要60次吧。。。有點兒太多了，一般大多數(shù)情況下25-40次足可以p出條帶了 |
4樓2017-02-10 11:51:32
小汰寶
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2樓2017-02-10 11:26:07
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10樓2017-02-15 16:25:18
wuqianqian
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3樓2017-02-10 11:35:33
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6樓2017-02-14 18:19:26
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7樓2017-02-14 18:20:00
8樓2017-02-15 09:29:03
9樓2017-02-15 09:54:28
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