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wuqianqian新蟲 (初入文壇)
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[求助]
新設(shè)計(jì)的引物怎么都p不出來 已有4人參與
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新設(shè)計(jì)引物跑PCR失敗，我的流程是95℃ 5min,95℃ 50s,50度30s,72℃1min循環(huán)60次，72℃最后延伸10min,摸了50℃ 54℃ 56℃都失敗了，我的目的片段是1000bp，求解啊，希望各位大神能指導(dǎo)一下，謝謝！ @biostar2009 @飛約瘋?cè)嗽?/u> @youlinglyw @wizardfan 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| p不出來有很多因素，1你用的模板是什么是質(zhì)粒還是基因組DNA，2加入模板的量的多少，過多或過少都會(huì)影響成功率，具體可以參照你使用的酶的說明書，3退火溫度可以參照TM值，但是不是絕對(duì)的，常用溫度50-60，有時(shí)40幾度也可以出條帶，4目標(biāo)條帶1kb，延伸72度時(shí)可以放寬時(shí)間稍微長一點(diǎn)兒1min10sec或更長，因?yàn)檎f明書寫1kb／min，那是理論參考，實(shí)際操作可以加長一些，5引物是否保證正確，反向引物容易出錯(cuò)，可以添加一陽性對(duì)照，用此引物肯定能p出條帶的，來確保反應(yīng)體系沒問題，6循環(huán)數(shù)一般沒必要60次吧。。。有點(diǎn)兒太多了，一般大多數(shù)情況下25-40次足可以p出條帶了 |
4樓2017-02-10 11:51:32
小汰寶
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2樓2017-02-10 11:26:07
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【答案】應(yīng)助回帖
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陽性對(duì)照你怎么做的？是同一種基因組DNA，換了另一對(duì)引物做的（p的是同一個(gè)基因只是陽性對(duì)照的引物p出的條帶大小和你設(shè)計(jì)的引物p出來的條帶大小不同）？如果是這樣，那可能就是你引物的問題，可能就需要考慮再設(shè)計(jì)一對(duì)引物，如果p的不是同一基因，可比性有但不高，可以再提高下你設(shè)計(jì)的引物pcr時(shí)退火的時(shí)間比如55度30s延長到45s或50s等。然后再增加循環(huán)數(shù)，35或40回。順便問一下，你這基因組DNA是啥的？植物？還是酵母菌還是啥。。。 |
10樓2017-02-15 16:25:18
wuqianqian
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3樓2017-02-10 11:35:33
5樓2017-02-13 09:58:04
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非常感謝您的解答，我開始用的菌液，后來改用基因組DNA，設(shè)立陽性對(duì)照是能p出來的，但是自己設(shè)計(jì)的引物卻p不出來，循環(huán)了30次。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-02-14 18:19:26
wuqianqian
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7樓2017-02-14 18:20:00
8樓2017-02-15 09:29:03
9樓2017-02-15 09:54:28
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