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真核細(xì)胞基因組的制備 已有1人參與
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從不同組織細(xì)胞或血細(xì)胞中提取是進(jìn)行基因診斷的先決條件。制備的原則是既要將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈，又要保持分子的完整。蛋白酶K的應(yīng)用使這兩個(gè)原則得到了保證。在提取的反應(yīng)體系中，SDS是離子型表面活性劑，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破壞細(xì)胞 膜；（2）解聚細(xì)胞 中的核蛋白；（3）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。蛋白酶K可將蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子盡量完整地分離出來。具體方法如下： （一）白細(xì)胞的制備 （1）采集外周靜脈血10ml，加1.7ml ACD（檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 滅菌30min）抗凝。 （2）將血液放入已滅菌的50ml塑料離心管內(nèi)，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100]，輕輕上下振蕩至透明，紅細(xì)胞 完全溶解。 （3）冰浴10min，離心，3000rpm，10min。棄上清，STMT重復(fù)處理1～3次。 （4）棄上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混勻，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，搖勻，置37℃水浴15～20h。 （5）用等體積飽和酚抽提，3000rpm離心5min。 （6）用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相，加飽和酚和氯仿-異戊醇（24：1）抽提，3000rpm離心5min 。 （7）小心吸取上層水相，用等體積氯仿-異戊醇（24：1），抽提，3000rpm離心5min。 （8）小心吸取上層水相，加入1/10體積3mol/l NaAc,2.5體積預(yù)冷無水乙醇混勻，-20℃過夜。 （9）將白色絮狀沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管內(nèi)，加1ml 75%乙醇4℃靜置1h，離心，10000rpm 10min。 （10）棄上清，用蠟?zāi)⒐芸诜夂�，針刺�?shù)個(gè)小孔，真空抽提（10～15min）。 （11）加200μl 1×TE溶解，置4℃保存。 （12）對所提用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測。 （13）取2～4μl 樣品，經(jīng)瓊脂糖凝膠（Agarose）電泳，檢查所提的質(zhì)量及降解情況。 （二）組織的制備 （1）將200mg組織在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB緩沖液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml帶蓋的塑料管中。 （2）加SDS至濃度為1%（可加0.4ml10%SDS），混勻。由于從核中釋放出來，樣品變得粘稠。 （3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，終濃度為100μl/ml，37℃保溫1～3d，直到組織完全解體。中間可振動(dòng)樣品管幾次。加0.4ml 5mol/L NaCl。 （4）用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm離心5min，用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。 （5）加2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段，并移入一新管，吸干中的無水乙醇。 （6）溶于4ml 0.1×SSC中，4℃過夜可作進(jìn)一步純化。 （7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保溫5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。 （8）同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀離心，棄上清。 （9）75%乙醇洗滌2次，離心，棄上清，真空抽干。適量1×TE溶解，保存在4℃。 |
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