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cherry_cao新蟲 (初入文壇)
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[求助]
重組質(zhì)粒雙酶切切不出片段 已有2人參與
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在構(gòu)建一個(gè)重組質(zhì)粒，載體再加上一個(gè)啟動(dòng)子（259bp），酶切用的是TAKARA 的Q.Cut Hind Ⅲ、PstⅠ，載體上有g(shù)fp基因片段，所以轉(zhuǎn)化子可以表現(xiàn)熒光檢測(cè)。 我挑取了發(fā)熒光的轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒，酶切，但是沒有切出來是怎么回事？  調(diào)過曝光還是看不見。 電泳圖左→右，Marker 1kb Plus、plasmid、酶切1、酶切2、Marker DL 2000 酶切.png |
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cherry_cao
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是曝光度大，為了找小片段； 空載體做了陽性對(duì)照并不會(huì)產(chǎn)生GFP，所以應(yīng)該是沒有自身攜帶啟動(dòng)子； 很尷尬的是啟動(dòng)子前面只有一個(gè)酶切位點(diǎn)Hind3，所以要換兩種酶這個(gè)想法做不了； PCR的結(jié)果是有目的條帶的T^T 我現(xiàn)在只能想是酶切位點(diǎn)變異，先去測(cè)序看看了 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-03-11 23:18:49
小冀-
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2樓2017-03-11 12:25:06
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-03-12 08:52:27
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-03-12 08:52:27
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你這是marker加多了還是曝光度沒有調(diào)好額，條帶都看不清楚，你這個(gè)載體空載的時(shí)候，gfp前面有啟動(dòng)子么？還是是專門檢測(cè)啟動(dòng)子的載體？可以重新做個(gè)酶切降低些質(zhì)粒量，或者再選擇其他的酶試試。另外可以用啟動(dòng)子的特異性引物或者通用引物，用質(zhì)粒做模板做個(gè)PCR驗(yàn)證看看。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-03-11 22:29:27
cherry_cao
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連的不對(duì)是指什么？ 嗯，我也猜會(huì)不會(huì)是突變了，但我還做過單酶切，兩種酶都沒切出來，如果突變，會(huì)發(fā)生兩個(gè)酶切位點(diǎn)都變異嗎？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2017-03-11 23:20:35
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