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lemon201399新蟲 (初入文壇)
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[求助]
熒光定量問(wèn)題求助 已有1人參與
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做熒光定量，可是內(nèi)參數(shù)值比18低而且不穩(wěn)定，用的內(nèi)參是gadph,我的模板已經(jīng)稀釋到了200ng每微升，不知道是什么原因，已經(jīng)心灰意冷！求指點(diǎn)�。� 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2017-03-31 21:22:16
lemon201399
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3樓2017-03-31 23:30:53
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4樓2017-04-01 00:03:26
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5樓2017-04-01 00:03:56
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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首先更正一個(gè)問(wèn)題，你的所謂200ng，指的是初始投入Total RNA的量，而不是cDNA，TotalRNA中，mRNA含量?jī)H為1%左右，所以你做完RT以后，cDNA的量也只有幾ng，這還要取決于你的RNA質(zhì)量好壞。 第二，內(nèi)參CT小于18說(shuō)明模板濃度太大，按照2μg TotalRNA逆轉(zhuǎn)錄20μl體系，可稀釋至200μl備用，投入量2μl，即：每樣品投入量2000ng/200μl*2=20ng（按totalRNA投入量計(jì)算）。 第三，不穩(wěn)定，說(shuō)明你的操作有問(wèn)題，SD應(yīng)小于0.5。先確定加樣的時(shí)候，樣品是否充分混勻，包括Q-PCR Mix和模板cDNA，若都混勻了，就說(shuō)明你的加樣量重復(fù)性不好，沒(méi)能保證每個(gè)重復(fù)的上樣量一致。這個(gè)多練練就好了。 以上，應(yīng)該能解決你的問(wèn)題  |
6樓2017-04-01 09:49:09
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