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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 相對定量熒光PCR求助
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[求助]
相對定量熒光PCR求助
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本人剛接觸分子，想請教各位牛人有關實時定量熒光PCR的一些問題。我要做不同土壤位點某類微生物的相對量的多少，所以想做相對定量PCR，初步的實驗思路如下： 1提取各位點土壤中的DNA。 2實時熒光PCR。將某位點的DNA連續(xù)稀釋7個10倍梯度，設定DNA的終拷貝數(shù)分別為100-10-7n/ul，用來做相對定量的標曲 3.已知這類微生物的特征基因A,用A基因擴增引物擴增上步中不同稀釋倍數(shù)DNA中的A基因及其他位點樣品的A基因。設定閾值，通過Ct值計算出各位點中A基因模板的相對拷貝數(shù)，從而得出各位點某類微生物的相對多少 不知道我的想法是不是對的？請各位指教，我會虛心接受大家的意見。另外我看好多有要管家基因，我這里需要管家基因嘛？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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西瓜
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【答案】應助回帖
物質鑒定(金幣+10): 謝謝，你的建議對我很重要 2011-10-04 13:03:18
1949stone(MolEPI+1): 鼓勵 2011-10-04 14:13:46
1949stone(MolEPI+1): 鼓勵 2011-10-04 14:13:46
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就是這樣了。內參基因是需要的，用于校正樣品量的差異。 附件是個人認為比較好的一個熒光定量PCR的PPT，本版里有一個關于熒光定量PCR的熱門資源，感興趣也可以看看：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3234286&fpage=1 祝假期愉快，一切順利！  |
2樓2011-10-03 17:38:00
紅多多
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應助回帖
物質鑒定(金幣+10): 謝謝，你的建議對我很重要 2011-10-04 12:59:45
1949stone(MolEPI+1): 鼓勵 2011-10-04 14:13:56
1949stone(MolEPI+1): 鼓勵 2011-10-04 14:13:56
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呵呵 你那個方法不需要用到內參的 因為你用的是拿一個位置的菌量作為參照，我建議你不要使用相對定量的方法，因為國際上這樣做是很少的，如果你想發(fā)好一點的文章建議你做成絕對定量 方法是將你需要的基因克隆到T載體里面，搖細菌提質粒DNA，然后通過分光光度計計算出質粒DNA的質量，由于你使用T載體的分子量和你克隆的片段分子量是知道的，所以你能求出某濃度溶液中目的基因的拷貝數(shù)。通過稀釋加上qPCR能得到一個ct值的標準曲線。利用這個標準曲線去計算你各個位置DNA濃度，這樣貌似比較科學。 |
3樓2011-10-04 12:39:57
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