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[交流] 【求助/交流】熒光定量pcr求助

最近剛剛做熒光定量，但是結(jié)果總是不好，有一點(diǎn)就是老達(dá)不到平臺(tái)期，已經(jīng)40個(gè)循環(huán)了，模板量已經(jīng)加到2ul(20ul體系)，但還是不行，不知道是為什么，達(dá)不到平臺(tái)期出來(lái)模板量低不知道還有沒(méi)有其他原因？請(qǐng)各位能幫忙分析下，謝了！

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1樓 2010-12-23 14:58:18

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love_st

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lianyi1989(金幣+1): 2010-12-23 19:33:35

上圖唄，還有，為什么非得到平臺(tái)，只要有平臺(tái)的趨勢(shì)就可以了

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2樓2010-12-23 16:52:56

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在雨中

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rainwander(金幣+1):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-23 18:54:35
lianyi1989(金幣+1): 2010-12-23 19:33:40

我曾經(jīng)碰到過(guò)類似的問(wèn)題。
如果你的模板沒(méi)有問(wèn)題的話，是不是可以考慮下你的PCR mix的質(zhì)量。

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3樓2010-12-23 18:28:23

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lianyi1989

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Originally posted by love_st at 2010-12-23 16:52:56:
上圖唄，還有，為什么非得到平臺(tái)，只要有平臺(tái)的趨勢(shì)就可以了

就是到最后指數(shù)期還沒(méi)完呢~這結(jié)果肯定沒(méi)法用啊

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4樓2010-12-23 19:33:25

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sutao1979

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scelab(金幣+2):歡迎多來(lái)交流！:tiger06: 2010-12-23 23:31:15
lianyi1989(金幣+1): 2010-12-25 11:07:13

這種情況和cDNA的quality有很大的關(guān)系，先看看你的reference gene怎么樣？如果也是ct 的value很高的話，或者沒(méi)有，那一定是cDNA的問(wèn)題
qcpr兩個(gè)因素很重要1：cDNA quality2：primer，可以從melting curve判斷

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5樓2010-12-23 20:28:58

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jurkat.1640

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樣品的濃度不夠吧

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7樓2010-12-23 22:09:31

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lovenlong

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好似你的體系有問(wèn)題哦！

lianyi1989(金幣+1): 2010-12-28 10:56:23

1.樓主的體系用的模板量是多少？各個(gè)反應(yīng)管是否一致?按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系來(lái)配，同時(shí)結(jié)合你用的試劑說(shuō)明書來(lái)配體系，一般不會(huì)有太大問(wèn)題。我做的10微升的體系一般10~30ng的模板就夠了。
2.達(dá)不到平臺(tái)期，有時(shí)候很難講清楚原因的�？赡苣阃瑯拥捏w系有時(shí)能行有時(shí)又不行，細(xì)節(jié)不好把握。我上個(gè)月58度退火做得很好，昨天就不行了，今天換57度退火做了兩次，第二次才行，不知道為啥。
3.最好是先做個(gè)梯度摸一摸退火溫度，不然就來(lái)個(gè)Touch Down吧。個(gè)人感覺(jué)退火溫度經(jīng)常是沒(méi)P好的主要原因。至于鎂離子什么的定量可以少去考慮。
4.先配反應(yīng)母液再分裝，做三個(gè)以上重復(fù)測(cè)試體系可能會(huì)對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有好處，特別是你以后做著做著老出問(wèn)題的時(shí)候很煩的。

補(bǔ)充：如果PCR達(dá)不到平臺(tái)期，定量結(jié)果很難看的，基本上沒(méi)用。。。

[ Last edited by lovenlong on 2010-12-27 at 14:37 ]

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8樓2010-12-27 14:36:22

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引用回帖:

Originally posted by lovenlong at 2010-12-27 14:36:22:
1.樓主的體系用的模板量是多少？各個(gè)反應(yīng)管是否一致?按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系來(lái)配，同時(shí)結(jié)合你用的試劑說(shuō)明書來(lái)配體系，一般不會(huì)有太大問(wèn)題。我做的10微升的體系一般10~30ng的模板就夠了。
2.達(dá)不到平臺(tái)期，有時(shí)候很難 ...

謝謝~我體系基本是按試劑說(shuō)明書來(lái)配的，就是加大了模板的量而已，退火溫度我是做普通pcr提前摸好的，感覺(jué)問(wèn)題應(yīng)該不大，上面有同學(xué)說(shuō)可能是模板質(zhì)量有問(wèn)題，我現(xiàn)在就在懷疑是不是真是我模板質(zhì)量的問(wèn)題...據(jù)你做的經(jīng)驗(yàn)，有沒(méi)有可能是這種原因呢？

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9樓2010-12-28 11:11:02

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楊芷

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

我做的熒光定量也是這種問(wèn)題，我做的是白細(xì)胞介素2的表達(dá)量，引物換了幾個(gè)都不太行，各位大仙有做過(guò)的，幫忙指點(diǎn)下，感激不盡。在線等候

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10樓2013-04-13 13:58:39

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凌波麗

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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，鼓勵(lì)應(yīng)助，分子生物版塊期待你的更多精彩。 2013-04-22 08:57:41

我覺(jué)還是應(yīng)該從PCR的專一性不夠角度找原因，尤其是引物的設(shè)計(jì)。

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11樓2013-04-16 23:38:32

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xanxus18

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樣品濃度不夠

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12樓2013-04-21 20:51:10

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簡(jiǎn)單回復(fù)

dashu-973326樓

2010-12-23 21:04 回復(fù)

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