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biofeixue

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[交流] 【求助/交流】熒光定量PCR與半定量的RT－PCR在設(shè)計(jì)引物時(shí)有什么區(qū)別？

熒光定量PCR與半定量的RT－PCR在設(shè)計(jì)引物時(shí)有什么區(qū)別？它們的產(chǎn)物在要求上有什么不同。謝謝！此外在NCBI中查的的序列ORIGIN后面跟是full cDNA sequence還是其它的序列？

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1樓 2011-04-01 08:26:15

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jiangzhiang

鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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1949stone(金幣+1): 鼓勵(lì) 2011-04-01 11:23:43
biofeixue(金幣+2): 謝謝! 2011-04-01 12:18:59

熒光定量設(shè)計(jì)引物不能有引物二聚體，產(chǎn)物大小在180-220bp，半定量沒(méi)什么要求吧，不過(guò)最好還是跟熒光定量用一樣的引物吧

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2樓2011-04-01 09:19:15

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西瓜

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1949stone(金幣+3, EPI+1): 學(xué)習(xí)一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金幣+2): 2011-04-01 12:18:08

熒光定量PCR的產(chǎn)物不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)由于反應(yīng)體系的過(guò)快消耗而得不到有效擴(kuò)增，使反應(yīng)偏離2的N次方的理論方程，這樣通過(guò)方程推演進(jìn)行的定量自然就不準(zhǔn)確了。產(chǎn)物的大小，綜合各家說(shuō)法，從100 bp到150 bp比較合適，不過(guò)這范圍也可以放寬到80 bp到300 bp。
熒光定量PCR如果是Sybr Green一類(lèi)的方法，因?yàn)闊晒馊玖蠒?huì)非特異地與雙鏈DNA結(jié)合，包括錯(cuò)配產(chǎn)物、引物二聚體等，都會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)干擾結(jié)果，所以引物的特異性要好，并且不要形成二聚體。
半定量看的是終產(chǎn)物，對(duì)于擴(kuò)增長(zhǎng)度的要求貌似沒(méi)啥要求把？不確定。因?yàn)榘攵康慕Y(jié)果是從膠上看的，產(chǎn)物與引物二聚體的條帶是可以區(qū)分開(kāi)的，所以二聚體的影響就沒(méi)那么嚴(yán)重。
其他的都差不多啦，總之就是熒光定量PCR對(duì)引物的要求比半定量要高點(diǎn)。

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3樓2011-04-01 11:23:08

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西瓜

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biofeixue(金幣+1): 謝謝! 2011-04-01 12:19:25

暈，樓主問(wèn)題才回答一般就出EPI了

ORIGIN后面的序列是全部序列，具體看你查的序列是啥玩意了。
如果是基因組測(cè)序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不僅含有多個(gè)基因的序列，還包括cosmid本身的序列。
如果是“Caenorhabditis elegans chromosome III, complete sequence”，那就是整個(gè)染色體的序列了……
像“Caenorhabditis elegans insulin receptor homolog (daf-2) mRNA, complete cds”，指的是mRNA的序列。
另外，在序列開(kāi)頭的信息里還會(huì)有類(lèi)似信息

FEATURES          Location/Qualifiers
   source       1..5817
                  /organism="Caenorhabditis elegans"
                  /mol_type="mRNA"
                  /strain="Bristol N2"
                  /db_xref="taxon:6239"
如 “/mol_type=”這一欄會(huì)告訴你整個(gè)序列是哪一類(lèi)分子的。

好像還是沒(méi)有回答樓主的問(wèn)題呢。不如你給個(gè)鏈接，我們?cè)賻湍憧纯础?

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4樓2011-04-01 11:55:40

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歡仔

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169126樓: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-01 11:55:40
暈，樓主問(wèn)題才回答一般就出EPI了

ORIGIN后面的序列是全部序列，具體看你查的序列是啥玩意了。
如果是基因組測(cè)序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不僅 ...

你好我想問(wèn)下設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量的引物有人說(shuō)要跨內(nèi)含子不懂呢

我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候用的是mRNA, complete cds 結(jié)尾的對(duì)不

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5樓2012-07-05 11:45:07

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西瓜

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引用回帖:

1269643樓: Originally posted by 歡仔 at 2012-07-05 11:45:07
你好我想問(wèn)下設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量的引物有人說(shuō)要跨內(nèi)含子不懂呢

我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候用的是mRNA, complete cds 結(jié)尾的對(duì)不...

跨內(nèi)含子就是說(shuō)你引物分別在兩個(gè)外顯子上，中間有一個(gè)大的內(nèi)含子。qPCR擴(kuò)增的片段一般就是150~300bp，隔了個(gè)大的內(nèi)含子的話，從基因組上擴(kuò)增就難了，可以避免基因組DNA的污染。

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6樓2012-07-05 12:02:08

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歡仔

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1269644樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-07-05 12:02:08
跨內(nèi)含子就是說(shuō)你引物分別在兩個(gè)外顯子上，中間有一個(gè)大的內(nèi)含子。qPCR擴(kuò)增的片段一般就是150~300bp，隔了個(gè)大的內(nèi)含子的話，從基因組上擴(kuò)增就難了，可以避免基因組DNA的污染。...

弱弱的問(wèn)下我們?cè)O(shè)計(jì)的引物不是根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)的嗎 mRNA, complete cds 我看后面跟的這個(gè) 所以以為是根據(jù)MRNA序列來(lái)設(shè)計(jì)的 mRNA 不是全部都是外顯子嗎

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7樓2012-07-05 12:30:53

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孫妙妙

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引用回帖:

1269645樓: Originally posted by 歡仔 at 2012-07-05 12:30:53
弱弱的問(wèn)下我們?cè)O(shè)計(jì)的引物不是根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)的嗎 mRNA, complete cds 我看后面跟的這個(gè) 所以以為是根據(jù)MRNA序列來(lái)設(shè)計(jì)的 mRNA 不是全部都是外顯子嗎

...

同問(wèn)，剛接觸熒光定量，真的搞不懂啊，各位大俠幫幫忙啊。

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8樓2012-12-06 18:00:37

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夏xiao寶

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7樓: Originally posted by 歡仔 at 2012-07-05 12:30:53
弱弱的問(wèn)下我們?cè)O(shè)計(jì)的引物不是根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)的嗎 mRNA, complete cds 我看后面跟的這個(gè) 所以以為是根據(jù)MRNA序列來(lái)設(shè)計(jì)的 mRNA 不是全部都是外顯子嗎

...

也同問(wèn)

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9樓2013-10-20 16:38:49

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