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【求助/交流】熒光定量PCR與半定量的RT－PCR在設(shè)計(jì)引物時(shí)有什么區(qū)別？
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| 熒光定量PCR與半定量的RT－PCR在設(shè)計(jì)引物時(shí)有什么區(qū)別？它們的產(chǎn)物在要求上有什么不同。謝謝！此外在NCBI中查的的序列ORIGIN后面跟是full cDNA sequence還是其它的序列？ |
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9樓2013-10-20 16:38:49
2樓2011-04-01 09:19:15
西瓜
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★ ★ ★
1949stone(金幣+3, EPI+1): 學(xué)習(xí)一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金幣+2): 2011-04-01 12:18:08
1949stone(金幣+3, EPI+1): 學(xué)習(xí)一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金幣+2): 2011-04-01 12:18:08
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熒光定量PCR的產(chǎn)物不宜過長，否則會(huì)由于反應(yīng)體系的過快消耗而得不到有效擴(kuò)增，使反應(yīng)偏離2的N次方的理論方程，這樣通過方程推演進(jìn)行的定量自然就不準(zhǔn)確了。產(chǎn)物的大小，綜合各家說法，從100 bp到150 bp比較合適，不過這范圍也可以放寬到80 bp到300 bp。 熒光定量PCR如果是Sybr Green一類的方法，因?yàn)闊晒馊玖蠒?huì)非特異地與雙鏈DNA結(jié)合，包括錯(cuò)配產(chǎn)物、引物二聚體等，都會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)干擾結(jié)果，所以引物的特異性要好，并且不要形成二聚體。 半定量看的是終產(chǎn)物，對(duì)于擴(kuò)增長度的要求貌似沒啥要求把？不確定。因?yàn)榘攵康慕Y(jié)果是從膠上看的，產(chǎn)物與引物二聚體的條帶是可以區(qū)分開的，所以二聚體的影響就沒那么嚴(yán)重。 其他的都差不多啦，總之就是熒光定量PCR對(duì)引物的要求比半定量要高點(diǎn)。 |
3樓2011-04-01 11:23:08
西瓜
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biofeixue(金幣+1): 謝謝! 2011-04-01 12:19:25
暈，樓主問題才回答一般就出EPI了 ORIGIN后面的序列是全部序列，具體看你查的序列是啥玩意了。 如果是基因組測序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不僅含有多個(gè)基因的序列，還包括cosmid本身的序列。 如果是“Caenorhabditis elegans chromosome III, complete sequence”，那就是整個(gè)染色體的序列了…… 像“Caenorhabditis elegans insulin receptor homolog (daf-2) mRNA, complete cds”，指的是mRNA的序列。 另外，在序列開頭的信息里還會(huì)有類似信息 FEATURES Location/Qualifiers source 1..5817 /organism="Caenorhabditis elegans" /mol_type="mRNA" /strain="Bristol N2" /db_xref="taxon:6239" 如 “/mol_type=”這一欄會(huì)告訴你整個(gè)序列是哪一類分子的。 好像還是沒有回答樓主的問題呢。不如你給個(gè)鏈接，我們再幫你看看。 |
4樓2011-04-01 11:55:40
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