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neau-wangyan鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
實時定量pcr中的internal是怎么回事 已有1人參與
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各位大牛，最近準備做血清樣本中病毒的實時定量PCR，有別人給的實驗方法和引物，但是發(fā)現(xiàn)protocol中，要檢測同一個病毒序列上的不同區(qū)的兩個片段，分別是FAM-TAMRA 和VIC-TAMRA 兩條標記的探針。問了以前做定量PCR的人，說是internal對照。 問題1：始終不明白檢測一條就可以證明該種病毒了啊，為什么要檢測兩條片段？ 問題2：兩條片段該用那一條算作是定量計算呢？ 相關(guān)于internal的這個問題，看到一篇文獻中在試驗方法中是這樣寫的： For the HDV internal control, a partial HDV sequence was internally modified and amplified by use of qRT-PCR to produce synthetic DNA, and the product was subcloned. For detection of the internal control, the probe was 5'-HEX– GCGATGGTGACTTTGTGGATAGTATCCTCA-3'-TAMRA. For the positive control for HDV, a region corresponding to nt 883–1265 was amplified, subcloned, and purified. 請問，這個文章中的internal control 又是什么意思，是要clone 制備標準品么？在同一個反應(yīng)管中也要檢測兩個片段么？ 還有一個問題，我做了幾次實驗，發(fā)現(xiàn)，目的片段，含量極低，第40個循環(huán)的時候曲線才剛剛抬頭，我把循環(huán)數(shù)增加到55，才能看到完整的曲線，同時設(shè)有陰性對照和陽性對照，陰性對照什么都沒有，想問一下，這樣直接增加循環(huán)數(shù)，看到在40個循環(huán)看到起峰，目的片段，算是陽性么？ 謝謝。  |
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2樓2017-04-18 07:43:20
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【答案】應(yīng)助回帖
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一般熒光定量PCR會有一條內(nèi)標，用來做對照，目的是控制提取和擴增的成功，無論檢測目標是否檢測到，內(nèi)標一定要正常起來。 然后熒光定量pcr40個ct才起來含量不是一般的低啊，現(xiàn)在一般的檢測試劑盒最高也是以ct=35為陰陽性分界點。 |
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neau-wangyan4樓2017-04-18 09:58:56
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6樓2017-04-25 06:49:49
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