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Zhibao1994新蟲 (小有名氣)
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[求助]
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 已有2人參與
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向各位請(qǐng)教下關(guān)于DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。我最近在做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將老師合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。第一步是將細(xì)胞從零下八十?dāng)z氏度中取出放入冰盒中半個(gè)小時(shí)，同時(shí)預(yù)冷兩個(gè)1.5ml的離心管，待細(xì)胞融化后，將細(xì)胞分裝于兩個(gè)離心管（離心管已標(biāo)注轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱），各100ul,第二步：加入2ul的質(zhì)粒，在冰上30分鐘。熱擊（42度，45秒)，然后冰上放2分鐘。第三步：加入SOC 0.9ml，然后在37度中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)，離心10分鐘，4000轉(zhuǎn)每分鐘。涂板（Kan，LB），37度培養(yǎng)隔夜觀察。老是只能看到幾個(gè)菌落。 @biostar2009 @youlinglyw 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-05-11 07:48:19
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你確定是使用農(nóng)桿菌感受態(tài)來(lái)做的嗎，按照你的描述應(yīng)該是DH5α的操作步驟。如果確定是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，步驟是不正確的，而且農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)需要2-3天，過夜沒有很正常。 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟： 1、 加1ug DNA于200ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘。 2、液氮中冷凍1分鐘。 3、37℃水浴溶化細(xì)胞。 4、 加1ml YEP培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)2-4hr（低速）。 5、離心1分鐘，懸浮細(xì)胞在100ul YEP培養(yǎng)基中。 6、涂板，28℃培養(yǎng)2-3天。 |
7樓2017-05-10 16:20:09
風(fēng)霜非暖
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3樓2017-05-09 23:02:20
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-05-10 07:55:08
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轉(zhuǎn)化弄桿菌:冰置30分鐘，37度1分鐘液氮2分鐘重復(fù)一次，冰置5分鐘，加不含抗生素LB，30度搖3個(gè)小時(shí)，涂板，30度倒置培養(yǎng)過夜。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-05-10 07:53:08
10樓2017-05-10 21:16:59
Romanticman
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4樓2017-05-10 06:27:37
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是說(shuō)感受態(tài)細(xì)胞的問題嗎？做感受態(tài)細(xì)胞時(shí)沒有液氮，所以就用零下80度條件下做的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-05-10 08:18:09
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8樓2017-05-10 18:21:59
9樓2017-05-10 19:07:14
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