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FND小青年銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
RACE通用引物 已有1人參與
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想請教一下race的3，5兩個(gè)通用引物是怎么設(shè)的，可以拿別人的來用嗎？設(shè)上下游引物要參考通用引物的Tm值嗎？最近做race有點(diǎn)頭疼 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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笨笨的云
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
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- 蟲號: 3814377
- 注冊: 2015-04-16
- 性別: MM
- 專業(yè): 微生物學(xué)
4樓2017-09-14 20:07:22
2樓2017-07-09 00:35:17
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1、SMARTTM 3'-RACE的原理 利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn),以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.然后用一個(gè)基因特異引物GSP1（gene specific primer,GSP）作為上游引物,用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer,UPM）作為下游引物,以cDNA第一鏈為模板,進(jìn)行PCR循環(huán),把目的基因3' 末端的DNA片段擴(kuò)增出來. SMARTTM 5'-RACE的原理 先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn),以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下,反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性,在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的5'末端時(shí)自動(dòng)加上3-5個(gè)（dC）殘基,退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后,轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）.然后用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer,UPM）作為上游引物,用一個(gè)基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer,GSP）作為下游引物,以SMART第一鏈cDNA為模板,進(jìn)行PCR循環(huán),把目的基因5'末端的cDNA片段擴(kuò)增出來.最終,從2個(gè)有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA,或者通過分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列,合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長cDNA. 2、UPM,NUP是兩個(gè)通用引物。序列分別 Upm: CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（長） CTAATACGAC TCACTATAGGGC（短） NUP 5’-AAGCAGTGGT AACAACGCAGAGT-3’ |
3樓2017-07-11 08:44:52
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