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碧川新蟲 (小有名氣)
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[求助]
測乙酰膽堿酯酶抑制活性 已有1人參與
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用國產(chǎn)96孔板測的，為什么陰性對照組的OD值比空白組還要小啊。難不成是誤差？會不會太大了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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硫代乙酰膽堿(ATch)在乙酰膽堿酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代膽堿,硫代膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412 nm處有光吸收的黃色物質(zhì),在酶催化反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)階段其 OD 值即可代表起始反應(yīng)速率。 方法： 2.65 mLPBS(pH 8.0),50μL 乙酰膽堿酯酶(0.85 U/mL) , 100 μL 15 mM DTNB 和樣品溶液100μL加入試管，37 ℃預(yù)熱 2 min，然后加入100 μL15 mM 硫代乙酰膽堿（起始濃度是0.5 mM），在 37 ℃ 保溫 20 min 后立即加入1 mL 0.4％SDS 終止反應(yīng)，將所得溶液立即在412nm下測量吸光值并根據(jù)下式計算抑制率： 抑制率(％)=[A對照-(A 樣品-A 樣品空白)]/A對照×100。 按照公式計算抑制率，以橫坐標(biāo)為酶促反應(yīng)體系中抑制劑的濃度，縱坐標(biāo)為抑制率，繪制曲線，計算其抑制率為50%時的抑制劑濃度，即為IC50。 |
2樓2017-07-17 23:59:51
小盧同學(xué)
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3樓2017-08-06 10:43:32
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我是根據(jù)文獻(xiàn)做的，140μL0.1M PB＋20μL待測樣品DMSO溶液＋20μL0.09u/ml酶溶液 混合 25℃孵化15min 再加10μL14mM ATCl 與10μL 14mM DTNB 10min后 410nm測OD值 毒扁豆堿作為陽性對照 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-08-09 09:53:05
碧川
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5樓2017-08-09 09:53:54
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6樓2017-08-09 17:12:41
碧川
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7樓2017-08-09 17:36:24
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會不會是酶濃度高了，降低酶活試一下！看有沒有活性！你看到的陽性對照物的ic50是終濃度嗎？如果是終濃度，那么你配的陽性對照物就按倍數(shù)換算回去！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2017-08-09 17:52:22
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9樓2017-08-09 21:06:08
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10樓2017-08-09 23:45:50
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