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一點(diǎn)就通，Trizol法提取RNA教程來(lái)一套 已有4人參與
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一. 實(shí)驗(yàn)原理 Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍能迅速破碎細(xì)胞，同時(shí)使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性并釋放出核酸；由于釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分別位于中間相和水相，從而使DNA和RNA得到分離；取出水相后，通過(guò)有機(jī)溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉淀，可得到純凈RNA。 二. 操作步驟 1．通過(guò)離心來(lái)沉淀細(xì)胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑反復(fù)吹打來(lái)裂解細(xì)胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在15—30°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。（每5—10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107 細(xì)菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。） 2．分離階段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下孵育2—3 分鐘。在2—8°C 下以不超過(guò)12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA 無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60% 3．RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1 mlTRIZOL 對(duì)應(yīng)0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 15—30°C 條件下孵育10 分鐘并在2—8°C 下以不超過(guò)12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 4．RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C 下以不超過(guò)7,500×g的離心力高速冷凍離心5 分鐘。 5．RNA的再溶解 在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無(wú)RNA酶的水或0.5% SDS溶液來(lái)溶解RNA，并在55—60°C下孵育10 分鐘。 三. 注意事項(xiàng) 1．樣品量和 Trizol 的加入量一定要按以上的比例，不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量，否則會(huì)使內(nèi)源性 RNase 的抑制不完全，導(dǎo)致 RNA 降解。 2．整個(gè)過(guò)程要及時(shí)更換手套，戴雙層口罩，并在操作區(qū)開(kāi)啟酒精燈。 3．RNA一定要貯存到-80℃冰箱，在-20℃保存時(shí)間很短。 4．配制的溶液應(yīng)用滅菌處理的DEPC水。 5．玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。 |
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3樓2017-10-13 17:39:05
2樓2017-10-13 17:18:21
胡爽157
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