 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2358 | 回復: 5 | ||||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||
[交流]
一點就通，Trizol法提取RNA教程來一套 已有4人參與
|
||||
|
一. 實驗原理 Trizol內含異硫氰酸胍能迅速破碎細胞，同時使核蛋白復合體中的蛋白變性并釋放出核酸；由于釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分別位于中間相和水相，從而使DNA和RNA得到分離；取出水相后，通過有機溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉淀，可得到純凈RNA。 二. 操作步驟 1．通過離心來沉淀細胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑反復吹打來裂解細胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在15—30°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。（每5—10×106的動物細胞，植物或酵母菌細胞或每1×107 細菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應避免洗滌細胞因為那樣會增加mRNA降解的可能性。） 2．分離階段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下孵育2—3 分鐘。在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA 無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60% 3．RNA的沉淀 將水樣層轉移到一干凈的試管中，通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 mlTRIZOL 對應0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 15—30°C 條件下孵育10 分鐘并在2—8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 4．RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C 下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5 分鐘。 5．RNA的再溶解 在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55—60°C下孵育10 分鐘。 三. 注意事項 1．樣品量和 Trizol 的加入量一定要按以上的比例，不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量，否則會使內源性 RNase 的抑制不完全，導致 RNA 降解。 2．整個過程要及時更換手套，戴雙層口罩，并在操作區(qū)開啟酒精燈。 3．RNA一定要貯存到-80℃冰箱，在-20℃保存時間很短。 4．配制的溶液應用滅菌處理的DEPC水。 5．玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。 |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子操作 |
» 猜你喜歡
求蛇床子素的pka值
已經(jīng)有1人回復
-
急！請問一下研究椎間盤組織工程的一篇review什么期刊比較容易投呢感謝！
已經(jīng)有1人回復
-
運動系統(tǒng)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有254人回復
-
對多糖進行DPPH、ABTS、超氧陰離子試驗得出樣本抗氧化順序不一致
已經(jīng)有2人回復
-
求助《藥物新劑型與新技術》一書
已經(jīng)有3人回復
-
考博，干細胞，與消化有關最好（碩士專業(yè)是消化內科）
已經(jīng)有0人回復
-
眼科丨小鼠眼球解剖特點與一般生理參數(shù)
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
5樓2017-10-18 21:24:15
|
謝謝分享！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2017-10-13 17:18:21
3樓2017-10-13 17:39:05
胡爽157
新蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2101.9
- 散金: 358
- 帖子: 146
- 在線: 39.6小時
- 蟲號: 4073314
- 注冊: 2015-09-15
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物化學
4樓2017-10-13 21:26:36
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 生物學一志愿985，分數(shù)349求調劑 +6 | zxts12 2026-03-21 | 9/450 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 08工學調劑 +7 | 用戶573181 2026-03-20 | 11/550 |
|
|
|
[考研]
 0854 考研調劑 招生了！AI 方向
+3
|
pk3725069 2026-03-19 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調劑 +8 | 困于星晨 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 尋找調劑 +4 | 倔強芒? 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
[考研] 260求調劑 +3 | 朱芷琳 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 311求調劑 +3 | 26研0 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 生物學調劑 +5 | Surekei 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +5 | Zhangbod 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學071000，求調劑 +4 | 沿岸有貝殼6 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 286求調劑 +10 | Faune 2026-03-21 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 化學調劑 +5 | yzysaa 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 266求調劑 +3 | 哇呼哼呼哼 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +6 | Mqqqqqq 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 299求調劑 +6 | △小透明* 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 329求調劑 +9 | 想上學吖吖 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +3 | eation27 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料，紡織，生物（0856、0710），化學招生啦 +3 | Eember. 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考博] 26博士申請 +3 | 1042136743 2026-03-17 | 3/150 |
|