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長大的小魚93新蟲 (小有名氣)
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[求助]
簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)以及PCR疑問，求助 已有2人參與
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定性實(shí)驗(yàn)確定所篩菌株含有我要的目的酶，但NCBI上該菌所注釋的全部基因沒有這個(gè)酶的基因，我想通過對(duì)比同屬的含有該酶的基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物來克隆該基因，現(xiàn)在有幾個(gè)問題想請(qǐng)教。 1、我篩的菌是原核菌株，可以直接根據(jù)保守序列來設(shè)計(jì)兼并引物，以我所篩的菌的全基因組為模版直接PCR就可以了嗎？有沒有什么需要注意的。我的菌是原核細(xì)菌，所以不用提取RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄吧？ 2、我使用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)了兩次引物，自己手動(dòng)選擇保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)了一次引物，溫度梯度PCR都試過了，但均沒有結(jié)果，請(qǐng)問大家有沒有什么設(shè)計(jì)兼并引物的建議？PCR時(shí)簡(jiǎn)并引物加的量需要增加嗎？新手剛開始做實(shí)驗(yàn)，希望有經(jīng)驗(yàn)的前輩可以指導(dǎo)一下，謝謝大家。@biostar2009@飛約瘋?cè)嗽?/u>@wizardfan@youlinglyw |
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長大的小魚93
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4樓2018-01-03 20:58:28
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2樓2018-01-02 12:31:16
【答案】應(yīng)助回帖
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1、進(jìn)行PCR的時(shí)候，不需要進(jìn)行RT，直接菌落PCR或者提取全基因組進(jìn)行PCR就可以 2、簡(jiǎn)并引物病不是說一條引物可以匹配多種突變點(diǎn)。舉個(gè)例子，如果模板某個(gè)位置是A/C的突變，公司合成的簡(jiǎn)并引物其實(shí)是兩條，一條在突變位置是A，一條在突變位置是C。換句話說，簡(jiǎn)并引物是含有突變情況的多引物的混合。所以如果你設(shè)計(jì)位置上突變較多，你的簡(jiǎn)并引物就是多條含有不同突變的引物混合，能夠和模板進(jìn)行完全匹配的會(huì)少，出現(xiàn)擴(kuò)增效率低的問題，可能導(dǎo)致沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。可以考慮增加引物量提高擴(kuò)增效率 3、如果這個(gè)酶是你轉(zhuǎn)到菌里面進(jìn)行表達(dá)的，建議你根據(jù)酶的氨基酸序列，反推出這個(gè)基因的序列，然后依據(jù)你反推的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證。或者使用載體質(zhì)粒的通用引物進(jìn)行pcr。 4、檢查一下你的pcr試劑是不是正常。進(jìn)行pcr平行驗(yàn)證，保證你配置的試劑是正常的。 5、加一點(diǎn)熒光染料進(jìn)你的pcr試劑做熒光pcr，有的時(shí)候如果產(chǎn)物很少，電泳可能看不出來，但熒光pcr能夠看到很少的產(chǎn)物的，能夠看到擴(kuò)增曲線，然后做個(gè)溶解曲線，可以確定產(chǎn)物不是引物二聚體 |
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3樓2018-01-03 09:24:08
納蘭暗香zc
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【答案】應(yīng)助回帖
CODEHOP軟件是在線的么？能否提供網(wǎng)頁鏈接，我在這https://virology.uvic.ca/virology-ca-tools/j-codehop/，可是需要JAVA環(huán)境，命名下載了Java為什么還是用不了，請(qǐng)指教啊 |
5樓2018-03-06 14:35:47
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