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優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。 已有4人參與
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優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào)，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號(hào)。而不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來(lái)不理想的結(jié)果。本文將為你介紹一些利用自動(dòng)洗板機(jī)來(lái)洗滌ELISA平板的技巧。 Tips： 免疫分析，比如ELISA，一般包含兩個(gè)或以上的孵育步驟，中間以洗滌隔開(kāi)。ELISA通常在96孔板中開(kāi)展，其上包被了結(jié)合抗原或抗體。在封閉步驟后，包被后的平板首先與一抗或抗原孵育。隨后通過(guò)一些洗滌步驟去除未結(jié)合（低親和力）的抗原-抗體復(fù)合物。接著，平板與二抗孵育。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。之后，又是一輪洗滌。最后是添加底物并檢測(cè)信號(hào)。 我們可使用多種底物來(lái)檢測(cè)最終的抗原-抗體復(fù)合物。底物分為三類：自然發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和熒光。準(zhǔn)確說(shuō)來(lái)，ELISA這個(gè)詞指的是使用自然發(fā)光底物的分析。而使用化學(xué)發(fā)光底物的分析被稱為L(zhǎng)uminescent Immunoassay（LIA），使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay（FIA）。 1洗滌參數(shù)： 第一個(gè)主要的參數(shù)是洗滌量。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過(guò)高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。 ELISA板的制造商通常會(huì)在試劑盒的使用手冊(cè)中列出包被量。行業(yè)中通常使用的包被量是200μl。如果你的試劑盒也是這樣，那么制造商可能會(huì)建議使用300μl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁。一般來(lái)說(shuō)，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。 2洗滌次數(shù)： 第二個(gè)影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度，使其難以測(cè)定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過(guò)，ELISA板的制造商會(huì)對(duì)洗滌次數(shù)提出建議。一般而言，制造商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。 控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過(guò)量的洗滌液。一般來(lái)說(shuō)，96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 μl。不過(guò)，有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是在分液的同時(shí)打開(kāi)吸液功能。換句話說(shuō)，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會(huì)溢出到其他孔中。 3抽吸： 另外，還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景（殘留量）和差異。 殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。 吸液高度會(huì)明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會(huì)使吸液效率降低，殘留量增加。 目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過(guò)程中自由上下移動(dòng)，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢�。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來(lái)更為復(fù)雜，因?yàn)槟阈枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板，那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí)，吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會(huì)下降到底部。 抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響；如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)（這很常見(jiàn)，因?yàn)楦欤�，那么抽吸的位置需要�?yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見(jiàn)的默認(rèn)位置。一般來(lái)說(shuō)，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。 反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。 如果沒(méi)有自動(dòng)洗板機(jī)，采用手工洗滌，那么也需要注意幾點(diǎn)。使用8道或12道微量移液器，采用倒吸的方法進(jìn)行洗滌；不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時(shí)需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，但盡量避免漏液溢液，以每孔300 μl為宜；板洗次數(shù)一般為3次，要保證洗板的浸泡時(shí)間，每次浸泡時(shí)間一般為30-60 秒；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板后進(jìn)行拍板，并及時(shí)更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi)。 ELISA看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是在實(shí)際操作過(guò)程中，也不能掉以輕心，還是應(yīng)該仔細(xì)檢查洗滌步驟，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。 |
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